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                                               田鼠痘病毒PCR檢測試劑盒說明書
 
產(chǎn)品名稱：田鼠痘病毒PCR檢測試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50次
運輸：低溫
保存：負(fù)20度
有效期：一年
貨期：現(xiàn)貨
田鼠痘病毒PCR檢測試劑盒產(chǎn)品及特點: 
 
因此快速靈敏檢測禽白血病病毒I亞群RT-具有重要意義,。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,，它具有下列特點：
 
1. 即開即用,，用戶只需要提供 DNA 模板。
 
2. 引物經(jīng)過精心優(yōu)化,，專一性強,，只擴(kuò)增禽白血病病毒I亞群RT-，與其他植物沒有交叉反應(yīng),。
 
3. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。
 
4. PCR mix 中含上樣染料,，PCR 后可以直接上樣電泳,。
 
5. 本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次,，但只能用于科研。
PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix（2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶（2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl     加ddH2O至50 μl  
田鼠痘病毒PCR檢測試劑盒視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增,。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃40s → 58℃30s → 72℃60s,，循環(huán)30-35次,，在72℃保7min。
3：結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油,；否則，直接取5-10μl電泳檢測,。
產(chǎn)品僅用于科研14℃或－20℃樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物,。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
需要自備的器材：
1．產(chǎn)品僅用于科研儀器：分析天平、離心機、熒光 PCR 擴(kuò)增儀,、組織研磨器,、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL,、20
µL,、200 µL、1000 µL）,。
2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管,、眼科剪、眼科鑷,、生理鹽水,、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL,、200 µL,、1000 µL）、滅菌雙蒸水,。
特點：
1.即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，操作簡單,，定量準(zhǔn)確快速,。
2. 引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性強,。預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長度為 560 bp,。
3. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳,。
4. 提供陽性對照,，便于分析試驗結(jié)果,。操作流程：
1.整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實驗服,、儀器,、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用,；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作,；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置,。
2.為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,。
3.每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照,。
4.試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時離心。
5.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨存放,。
6.為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記,。
7.儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用,。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,，淬滅基因選擇None。
9.實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄,。
田鼠痘病毒PCR檢測試劑盒儲存條件：
14℃或－20℃樣品收集,、處理及保存方法
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5.保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
 反應(yīng)五要素：

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶,、dNTP,、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段,。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補,，否則會形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,， 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
運輸及保存：低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置,，不要污染其他試劑,。
 
自備試劑：樣品 DNA。