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胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)原理
閱讀：132 發(fā)布時(shí)間：2020-5-15| 提 供 商 | 上海谷研實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 15.6KB |
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胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒說明書
產(chǎn)品名稱:胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒
英文名稱:Actinobacillus pleuropneumoniaePCR
技術(shù)特點(diǎn)：
1胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒在哪里有賣準(zhǔn)確可靠,，臨床雙盲對照試驗(yàn)＞1000例，結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)測序法比對，結(jié)果*性大于99%。
2高靈敏：可檢測低至10ng的人基因組DNA。
3快速：整個檢測流程只需3小時(shí),。
4產(chǎn)品僅用于科研簡便：試劑盒提供預(yù)混好的試劑，使體系配置操作簡便,。
5防污染
6高特異性：雙重特異性組成,，保證檢測結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性引物與DNA互補(bǔ)鏈結(jié)合必需*配對，才能延伸,。探針特異性與所檢測基因的PCR產(chǎn)物配對,，在延伸中產(chǎn)生熒光。
產(chǎn)品及特點(diǎn)：
1. 即開即用,，用戶只需要提供伴放線放線桿菌樣品,。
2. 根據(jù)伴放線放線桿菌保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng),。
4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染,。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR,。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2,、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）,，分別配制成200 U/L,，100 U/L，50 U/L,，25 U/L,，12.5 U/L，6.25 U/L,，3.12 U/L,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推,。
3,、 樣品稀釋液：1×20ml。
4,、 檢測稀釋液A：1×10ml,。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml,。
胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒使用方法：
一,、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供可以直接使用的DNA段作為陽性對照,。
2. 標(biāo)記6個離心管，分別為7,，6,，5，4,，3,，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）,。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。
6. 換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用,。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,，必須設(shè)置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC。另外用水作為NC,。如果每次制備需要200μL樣品,，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照,，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍,。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）
儲存條件及有效期:
-20℃避光保存,，避免反復(fù)凍融,，有效期6個月。
【胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測試劑盒適用儀器】:
ABI7300,、ABI7500,、LightCycler 480、iCycleriQ5,、CFX96,、SLAN等熒光定量PCR儀。
【樣本采集,、存放及運(yùn)輸】
u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集,；
u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）,；
u 運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1）RT-PCR可以檢測組織,、細(xì)胞,、血液、細(xì)菌等很多材料,，不同的樣本有不同要求,，實(shí)驗(yàn)前請充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；
2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息,、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號,；
3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品,。
4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中,。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,，*通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加,。運(yùn)用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析,。
主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析,、基因表達(dá)差異分析、基因分型。
主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì),、RNA提取,、cDNA合成、qPCR,。