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人1,25-二羥基維生素D3ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被人1,25-二羥基維生素D3（1,25(OH)2D3）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人1,25-二羥基維生素D3（1,25(OH)2D3）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度,。
 
樣本處理及要求
1.  血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.  組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融,。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測。
4.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。

標(biāo)本處理
1.  本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé),，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本,。
2.  實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量,，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行稀釋,，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍,，計(jì)算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。標(biāo)本使用0.01mol/L的PBS稀釋(PH=7.0-7.2),。
3.  若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中,，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性，并注意留存樣本,。
4.  使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差,。
5.  若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多,，如：細(xì)胞狀態(tài),、細(xì)胞數(shù)量、采樣時間等,，所以可能存在檢測不出的情況,。
6.  某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白,，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配,，而不被檢測出。
7.  建議使用新鮮樣本,，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差,。
 
需要而未提供的試劑和器材
酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
37℃恒溫箱
蒸餾水或去離子水
 
試劑盒組成
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標(biāo)板
8孔×12條
8孔×6條
無
標(biāo)準(zhǔn)品
0.3mL*6管
0.3mL*6管
無
樣本稀釋液
6mL
3mL
無
檢測抗體-HRP
10mL
5mL
無
20×洗滌緩沖液
25mL
15mL
按說明書進(jìn)行稀釋
底物A
6mL
3mL
無
底物B
6mL
3mL
無
終止液
6mL
3mL
無
封板膜
2張
2張
無
說明書
1份
1份
無
自封袋
1個
1個
無
人1,25-二羥基維生素D3ELISA試劑盒備注：
1.  標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：48、24,、12,、6、3,、0 ng/mL
2.  經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過zui大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時,，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。
 
注意事項(xiàng)
嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。
洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。
消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。
底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果,。
在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射,。
平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。
不能使用過期產(chǎn)品。
如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
 
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用,。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
 
操作步驟
1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3.  樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。
4.  除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.  棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6.  每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。
7.  每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
 
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程,，計(jì)算出樣品的濃度,。
 
人1,25-二羥基維生素D3ELISA試劑盒試劑盒性能
1.  檢測范圍：1.5 ng/mL – 48 ng/mL。
2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL,。
3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。
4.  重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% ,。