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牛整合素αM型酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒實(shí)驗(yàn)原理
閱讀：491 發(fā)布時(shí)間：2017-8-31| 提 供 商 | 上海谷研實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 64KB |
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牛整合素αM型酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中牛整合素αM型(ITG αM/CD11b)水平,。用純化的牛整合素αM型(ITG αM/CD11b)抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入整合素αM型(ITG αM/CD11b),，再與HRP標(biāo)記的整合素αM型(ITG αM/CD11b)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的整合素αM型(ITG αM/CD11b)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中牛整合素αM型(ITG αM/CD11b)濃度,。
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行,。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
牛整合素αM型酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒操作步驟
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*,、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻,；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五、第六孔中,，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,，混勻,；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為9ng/ml,，6ng/ml，3ng/ml,，1.5ng/ml，0.75ng/ml）,。
加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、待測(cè)樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。
配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。
洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干,。
加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外。
溫育：操作同3,。
洗滌：操作同5。
顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.
終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。
底物請(qǐng)避光保存,。
嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準(zhǔn)。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上,。
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和15%
檢測(cè)范圍：
0.2ng/ml -9ng/ml 保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃,。
2．牛整合素αM型酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒有效期：6個(gè)月