化工儀器網(wǎng)
技術文章
阿留申病病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒反應流程常規(guī)程序
閱讀：276 發(fā)布時間：2022-9-27阿留申病病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒反應流程常規(guī)程序:
將PCR反應所需的成分配置完后,，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性,，然后進入擴增循環(huán),。在每一個循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性,，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間）,，一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火,；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段）,，使引物在模板上延伸，合成DNA,，完成一個循環(huán),。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNA片段大量累積,。最后,，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整,，4℃保存,。
2．復性（退火）和延伸溫度
復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間,。具體的溫度主要由引物的Tm值決定,。延伸溫度絕大多數(shù)設定為72℃。如果復性的溫度很高,，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度,，變成二步法PCR。
3．反應時間
變性步驟一般使用30秒鐘,，如果模板的G+C含量較高,，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長,。復性時間有30秒種一般是足夠的,。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間,。
4．循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關,，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時，循環(huán)數(shù)通常為25～35次,。
平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象,。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低,，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產物抑制作用,，非特異性產物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用,，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不*,。
5．PCR反應液的配制
PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行,。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣，在最后加入DNA聚合酶,。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā),。
對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產物,。在遇到這個問題時,，如果將反應成分分開配制，A管含模板,、引物和dNTP,，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液,、DNA聚合酶和水,，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題,。
按照常規(guī)的方法配制反應體系,，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題,。將dNTP,、緩沖液，Mg2+和primer先配制好,，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100）,，加熱熔化，再冷卻,，使蠟將溶液封住,，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后,，蠟層熔化,，所有反應成分才會混合在一起。
phospho-AMPK alpha 2 (Ser176)磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α2抗體
phospho-AMPK alpha 2 (Ser491)磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α2抗體
phospho-Androgen Receptor (Ser515)磷酸化雄激素受體抗體
phospho-Androgen Receptor (Ser791)磷酸化雄激素受體抗體
phospho-Androgen Receptor (Ser94)磷酸化雄激素受體抗體
phospho-Androgen Receptor (Tyr363)磷酸化雄激素受體抗體
ANKK1錨定蛋白重復結構域蛋白激酶ANKK1抗體
phospho-alpha Adducin (Thr445)磷酸化內收蛋白抗體
Annexin A11膜粘連蛋白11抗體
Annexin A13膜粘連蛋白13抗體
phospho-ACTH (Ser168)磷酸化促腎上腺皮質激素ACTH抗體
phospho-AKT1 (Ser246)磷酸化蛋白激酶AKT1抗體
phospho-AKT1/3 (Tyr473)磷酸化蛋白激酶B抗體
phospho-alpha 1 Sodium Potassium ATPase (Tyr260) 磷酸化鈉鉀ATP酶蛋白a1抗體
phospho-alpha Adducin(Ser436)磷酸化內收蛋白a1抗體
phospho-AMPK alpha 1 (Ser487)磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1抗體
phospho-AMPK alpha 2 (Ser345)磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α2抗體
ASAH1酸性神經(jīng)酰胺酶1抗體
ADRM1粘附調節(jié)分子1抗體
Aphrodisin氣味結合蛋白抗體
ALDH2乙醛脫氫酶2抗體
Annexin A10膜粘連蛋白10抗體
Anterior Gradient 2前梯度同源蛋白2抗體
ALDH1B1乙醛脫氫酶5抗體
ALF通用轉錄因子IIA樣因子抗體
ATG4D自噬相關蛋白4D抗體