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G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系
點(diǎn)擊次數(shù)：1591 發(fā)布時間：2014-11-25
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml,，過濾消毒，4度保存,。
2.細(xì)胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細(xì)胞,，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時左右開始加藥,。
3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml~1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度,，比如先做個100ug/ml、400ug/ml,、800ug/ml,、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基,。
4.加G418篩選：吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基,，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基,。
5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況,，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4.
6.確定*篩選濃度：在篩選10~14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的zui小G418濃度即為*篩選濃度,。在*輪就篩選出*G418濃度的可能性不大,，zui有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了,。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞,，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒耍瑒t可以再用500ug /ml,、600ug/ml,、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定*篩選濃度,！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的*用量還是比較穩(wěn)定的,，所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,，現(xiàn)在我告訴你我測試過NIH3T3細(xì)胞對G418的敏感性,，我用的篩選濃度是200 ug/ml，這時你就可以做150ug/ml,、200ug/ml,、 300ug/ml三個濃度進(jìn)行篩選。
通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了*篩選濃度后,，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了,。
a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時或者更長，到細(xì)胞增長接近匯合時按1:4密度傳代,，繼續(xù)培養(yǎng),，待細(xì)胞密度增至50%~70%匯合時；
b 加G418：去掉培養(yǎng)液,，PBS洗一次,，加入按*篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基,。
c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基,。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時,，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選10~14天后,，可見有抗性的克隆出現(xiàn),，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后,；
d 挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù),，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個/10ul,。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔,。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖,。
e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA,做RT-PCR檢測目的基因是否存在,。