簡(jiǎn)介
3D 生物打印被定義為細(xì)胞和生物相容性材料功能性 3D 結(jié)構(gòu)或人工組織模型,。1 這項(xiàng)技術(shù)改變了組織工程領(lǐng)域,，使得創(chuàng)建復(fù)雜的預(yù)定義設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)成為可能，同時(shí)確?？芍貜?fù)性,。幾種基于 3D 生物打印的方法已報(bào)告用于工程化各種組織，如軟骨,、2 骨,、3 以及皮膚再生。4 該技術(shù)也被用于創(chuàng)造新的臨床前腫瘤模型,。事實(shí)上,，作為 2D 細(xì)胞培養(yǎng)模型由于缺乏預(yù)測(cè)性而受到越來(lái)越多的質(zhì)疑， 3D 生物打印已成為一種替代方法通過(guò)處理不同的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)衍生分子,，腫瘤微環(huán)境的建模 / 展示 (TME) 來(lái)規(guī)避這個(gè)問(wèn)題,。許多基于 3D 生物打印的腫瘤模型包括肺癌、5 乳腺癌和 6 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,。7 這些模型在設(shè)計(jì)方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì),，與其他策略相比具有靈活性和可重復(fù)性如 細(xì)胞球和類(lèi)器官。 卵巢癌是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題,，3D 生物打印仍作為 卵巢癌模型仍在研究中,。在此類(lèi)腫瘤類(lèi)型中,，顯示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 與癌細(xì)胞發(fā)生密切相互作用，在癌癥侵襲和耐藥中發(fā)揮主要作用,。8,，9 因此 CAFs 是設(shè)計(jì)卵巢癌模型的關(guān)鍵。
優(yōu)勢(shì)
高內(nèi)涵篩選和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有助于表征和驗(yàn)證 3D 生物打印實(shí)驗(yàn) • 瞬時(shí)基因表達(dá)是增加 3D 生物打印模型的多功能性的有力工具 • 多波長(zhǎng)分析工具對(duì)于充分利用 3D 生物打印模型的強(qiáng)大功能進(jìn)行研究不同細(xì)胞類(lèi)型群體在模型內(nèi)的相互作用是必需的在此應(yīng) 用說(shuō) 明 中,，3D 生物打印用于創(chuàng)建包含癌細(xì)胞 ( SKOV3 細(xì)胞 ) 和 CAF 成纖維細(xì)胞 ( MeWo 細(xì)胞 ) 的卵巢癌模型,。使用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SKOV3 細(xì)胞和并用 CellTracker 和 Orange CMRA Dye (ThermoFisher) 將 MeWo 細(xì)胞染色。兩種細(xì)胞類(lèi)型均包含在明膠 - 藻酸鹽 - 基于水凝膠以獲得用于形成圓柱形腫瘤樣結(jié)構(gòu),。模型的均相性以及這些腫瘤內(nèi)細(xì)胞分布的可重復(fù)性,，使用 ImageXpress Pico 進(jìn)行評(píng)估成像系統(tǒng)。
結(jié)果和討論
如圖 1 所示,，生物打印結(jié)構(gòu)成像顯示表達(dá) GFP 的 SKOV3 細(xì)胞和熒光染色的 MeWo 細(xì)胞均質(zhì)分布于明膠 - 藻酸鹽 基體 ( 圖 1A 和 B ),。這非常重要，因?yàn)橥|(zhì)細(xì)胞分布均勻分布在生物墨水中是 3D 打印過(guò)程中需要考慮的重要因素 12 此外,，天然 TME 是已知包含多種緊密相互作用的細(xì)胞類(lèi)型,。13 因此，重現(xiàn)這一點(diǎn)至關(guān)重要,，同時(shí)構(gòu)建體外腫瘤模型以促進(jìn)癌癥和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用,。
而腫瘤中應(yīng)結(jié)合多種細(xì)胞類(lèi)型以更好地模擬 TME 異質(zhì) 性，每種細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)量及其比例需要加以控制以確?？芍貜?fù)性,。ImageXpress Pico 是一個(gè)特別適合用于實(shí)現(xiàn)此類(lèi)控制，因其可以快速輕松地捕獲多張顯微鏡圖像,。 軟件 CellReporterXpress 允許對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量即使是厚樣品,，也可使用 Z-stack 的最大投影實(shí)現(xiàn)。在此應(yīng)用說(shuō)明中,，此系統(tǒng)用于分析我們的生物打印腫瘤模型在細(xì)胞數(shù)量和比例方面顯示出良好的可重復(fù)性在 6 個(gè)生物打 印的結(jié)構(gòu),，SKOV3 細(xì)胞的平均數(shù)量 ( 細(xì)胞計(jì)數(shù) FITC ) 為 837 ± 200 ( 標(biāo)準(zhǔn)差 ≤ 25% )。對(duì)于 MeWo 細(xì)胞 ( 細(xì)胞計(jì) 數(shù) TRITC ),，平均數(shù)量為 3264.50 ± 462 (StD ≤ 15%),。

圖 1 分析含有轉(zhuǎn)染 GFP 質(zhì)粒的 SKOV3 細(xì)胞和經(jīng) CellTracker Orange 染色的 MeWO 細(xì)胞的 3D 生物打印結(jié)構(gòu) CMRA 染料。A) 使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng) (4X,，Z-stack) 采集的孔 B3 中 3D 生物打印結(jié)構(gòu)的 FITC 和 TRITC 圖像,。B) 分析使用 CellReporterXpress 軟件創(chuàng)建的 FITC 和 TRITC 細(xì)胞計(jì)數(shù)的 掩膜。C) 樣品的 FITC 和 TRITC 通道中的平均細(xì)胞數(shù)量 (5 孔,，染色和轉(zhuǎn)染 ) 和陰性對(duì)照 (3 孔,，未染色和未轉(zhuǎn)染 )。D) 轉(zhuǎn)染效率的評(píng)估,，使用 GFP 質(zhì) 粒和 jetOPTIMUS-Polyplus-transfection-transfection 試劑盒 (FITC 陽(yáng)性細(xì)胞百分比 /TRITC 陽(yáng)性細(xì)胞 ),。

材料和方法
水凝膠制備
對(duì)于水凝膠制備，所需質(zhì)量的對(duì)明膠和海藻酸鈉粉末進(jìn)行稱(chēng)重,，在紫外線下 1 小時(shí),，然后溶解在 Dulbecco 改 良 EagleMedium 中混合lowest必需培養(yǎng)基 (MEM)，補(bǔ)充有 10% 胎牛血清,。所得溶液為然后在磁力攪拌下在 37℃ 下 保持過(guò)夜,，complete均質(zhì)化。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和染色根據(jù)制造商的說(shuō)明,，使 用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SKOV3 細(xì)胞,。10 簡(jiǎn)言之，適量的 DNA 稀釋至 jetOPTIMUS 緩沖液并適當(dāng)?shù)募尤?jetOPTIMUS 轉(zhuǎn)染試 劑,。轉(zhuǎn)染溶液在室溫下保存 10 分鐘,，然后添加到培養(yǎng)的 SKOV3 細(xì)胞中，以 60–80% 融合度培養(yǎng)在 T75 燒瓶中,。 使 用 CellTracker Orange CMRA 染 料 (ThermoFisher) 對(duì) MeWO 細(xì)胞進(jìn)行染色,，按照制造商的說(shuō)明,。11 簡(jiǎn)言 之，將染料溶解在 DMSO 中制備工作溶液,，然后稀釋在 MEM 培養(yǎng)基中,。將細(xì)胞在 37℃ 孵育 30 分鐘。 然后取出試劑溶液,，替換為新鮮的complete培養(yǎng)基,。

圖 2 用于對(duì)卵巢癌模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物打印和成像的方法示意圖。