簡介

凋亡是一種重要的機制,，可向胚胎發(fā)育等正常過程以及癌癥和神經(jīng)退行性疾病等疾病過程中的細胞發(fā)出程序性死亡的信號,。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 檢測試劑盒可通過使用 NucView 488 Caspase-3 底物檢測完整細胞群內(nèi)的凋亡。該底物由熒光 DNA 染料偶聯(lián) caspase-3/7 DEVD 識別序列組成,。最初是非熒光的,，它會滲透細胞膜。如果細胞是凋亡的,，底物會被 caspase-3/7 裂解，釋放出進入細胞核并與 DNA 結合的染料,，從而產(chǎn)生亮綠色熒光,。細胞可以活細胞成像，無需洗滌步驟即可去除死細胞或凋亡細胞,，但染料在固定后也會被保留,。

這種靈活的檢測可使用 ImageXpress® Micro 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和 MetaXpress® 分析軟件進行，以計算孔中凋亡細胞的發(fā)生率,。

材料

• EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 檢測試劑盒（Explorer Kit Cat. No. R8350 or Bulk Kit Cat. No. R8351, DMSO formulation）

• CHO M1WT3 細胞

• Camptothecin喜樹堿

• 384 孔黑色透明底微孔板 （Corning Falcon）

• DRAQ5 核染色

• ImageXpress Micro 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)

檢測方法

CHO 細胞以每孔 3,，500 個細胞、每孔 50 μL 的密度接種于經(jīng) 384 孔組織培養(yǎng)處理的微孔板中,。允許它們在37°C,、5% CO2的培養(yǎng)箱中附著并生長過夜。然后,，將孔用從 100 μM 至 0.1 μM 的 1：2 梯度稀釋的喜樹堿（抗癌藥物）處理 24 小時,，誘導凋亡。

在溫暖的培養(yǎng)基中制備了 10 μM 2X NucView 488 底物工作溶液,。從每個孔中小心抽吸 25 μL,，并替換為 25 μL 2X 底物溶液，最終濃度為 5 μM,。將細胞在 37°C 下孵育 1 小時,，之后以 10 μL 的量向每個孔中加入 6X DRAQ5 核染料溶液,，最終濃度為 2 μM。孵育 30 分鐘后，使用 FITC 和 Cy5 濾光片組以及 10X Plan Apo 物鏡在 ImageXpress Micro 系統(tǒng)上讀取孔板（圖 1）,。在此放大倍數(shù)下，一個視野通常捕獲 1,，1001,，400 個細胞核，以便一個圖像產(chǎn)生統(tǒng)計學相關結果,。

圖 1：NucView Caspase 3/7 染色細胞（綠色）和 DRAQ5 核染色（紅色）的圖像疊加,。（頂部）經(jīng) 50 μM 喜樹堿處理的細胞表現(xiàn)出高凋亡細胞核發(fā)生率,。（底部）未經(jīng)處理的對照組顯示很少有細胞核具有凋亡染色。

兼容此 Molecular Devices 系統(tǒng)

ImageXpress Micro 高內(nèi)涵
成像系統(tǒng)

數(shù)據(jù)分析

將在 ImageXpress Micro 成像系統(tǒng)上拍攝的細胞,，使用細胞分類模塊在 MetaXpress 軟件中進行分析,。通過直觀的用戶輸入，該模塊可識別 DRAQ5 染色細胞核作為總細胞計數(shù),，并將Caspase 3/7 陽性細胞核分類為凋亡細胞核,。可評估如核大小,、強度和凋亡百分比等多個參數(shù),。如果對化合物暴露產(chǎn)生的總毒性干擾凋亡評估，則分析中可省略細胞計數(shù)低于特定數(shù)量的孔,。

結果

繪制凋亡細胞百分比與喜樹堿濃度的關系圖并應用 4 參數(shù)曲線擬合,，得到 EC5₀ 值為 5.7μM 的濃度反應曲線（圖 2）。EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 檢測試劑盒與 ImageXpress Micro 系統(tǒng)和 MetaXpress 軟件配合使用,，可為科學家提供快速,、可靠的基于圖像的細胞凋亡定量。