簡介

為了表現(xiàn)生物系統(tǒng)的復(fù)雜性,，化合物篩選細胞模型已變得更加復(fù)雜?；罴毎上窈腿S模型可提供對活細胞結(jié)構(gòu)和細胞過程的寶貴見解,。最近，在開發(fā)代表肝臟1,、胰腺2,、神經(jīng)元3和心臟組織4等不同類型人體組織的復(fù)雜類器官模型方面取得了巨大進展,。心臟細胞球可在體外收縮，并對不同調(diào)節(jié)劑的作用作出反應(yīng),。在此,，我們描述了一種包括成像和分析方案的方法，該方法可用于體外監(jiān)測和表征心臟細胞球的搏動模式,。

在心臟毒性研究中,，能夠查看搏動心肌細胞的實時行為，使科學(xué)家能夠通過使用透射光,、相差和熒光成像從單次檢測中收集多參數(shù)結(jié)果。在藥物開發(fā)的早期階段篩查化合物心臟毒性可大大降低因不良心血管影響而導(dǎo)致的晚期藥物失敗相關(guān)的成本,。這已促成開發(fā)生物相關(guān),、高通量和高內(nèi)涵篩選工具，如心肌細胞球,。

高內(nèi)涵篩選檢測可產(chǎn)生大量數(shù)據(jù),，且需要快速和自動分析。SoftMax® Pro 導(dǎo)入功能允許您分析任何科學(xué)來源的數(shù)字數(shù)據(jù),，包括高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（圖 1）,。通過將基于圖像的熒光強度數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SoftMax Pro 軟件，我們能夠說明和量化一組心臟毒性化合物處理的心肌細胞球的跳動模式,。

優(yōu)勢

分析基于圖像實驗的數(shù)字數(shù)據(jù)

使用 SoftMax Pro Peak Pro 分析算法快速定量心肌細胞的搏動模式

導(dǎo)入從任何科學(xué)儀器采集的原始數(shù)據(jù),，以便使用一個軟件系統(tǒng)進行分析

材料和方法

將細胞球大鼠心肌微組織（瑞士 InSphero AG）在 96 孔 GravityTRAP （InSphero AG） 檢測板中培養(yǎng)。在添加 DMSO,、0.1 µM 異丙腎上腺素,、0.1 µM 普萘洛爾、1 µM 維拉帕米,、1 µM 西沙必利或 1 µM 利*卡因 30 分鐘之前,，用鈣染料（EarlyTox 心臟毒性試劑盒，# R8210,，Molecular Devices處理細胞球兩小時,。

使用 ImageXpress® Micro XLS 系統(tǒng)以 10 倍物鏡每秒十次延時成像，共 300 個時間點,。該系統(tǒng)是一種寬場自動化 （1x-100x） 顯微鏡,，能夠?qū)潭ɑ蚧罴毎麢z測、組織和小生物進行熒光,、透射光和相差成像,。

使用 MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件對延時圖像進行定量，以測量熒光強度 （FI）,。動力學(xué) FI 值被導(dǎo)出到 Microsoft Excel 中,，排列到基于 Excel 的導(dǎo)入模板中,，并導(dǎo)入到 SoftMax Pro v6.4.2 中。使用預(yù)先編寫的心肌細胞跳動 i3（高級）方案分析數(shù)據(jù),，以自動計算十四個峰值屬性：峰值計數(shù),、峰值頻率、峰值振幅,、平均峰值寬度和標準差,、平均峰值上升時間和標準差、平均峰值衰減時間和標準差,、平均峰值間隔和標準差,、平均峰值底部寬度和標準差以及峰值規(guī)律性。

圖 2. 心肌細胞球延時圖像,。 該圖像序列顯示對照大鼠心肌細胞球 （InSphero AG） 的一次搏動,，這與細胞質(zhì)鈣的增加相對應(yīng)，表現(xiàn)為鈣敏感染料的熒光信號增加,。

結(jié)果

在本研究中,，使用一組心臟毒性化合物處理來自 InSphero 的搏動細胞球大鼠心肌微組織，并使用 EarlyTox 心臟毒性試劑盒進行檢測,，該試劑盒含有鈣敏感染料,，該染料經(jīng)優(yōu)化可測定與心肌細胞收縮相關(guān)的細胞質(zhì)鈣濃度變化,。使用 ImageXpress Micro XLS 系統(tǒng)拍攝經(jīng)處理的心肌細胞球的延時圖像,，以觀察搏動行為（圖 2）。通過基于 Excel 的導(dǎo)入功能模板將所得熒光強度振蕩導(dǎo)入 SoftMax Pro v6.4.2,，以定量峰值參數(shù)和化合物對心臟搏動的影響（圖 3a）,。與對照組相比，異丙腎上腺素處理的心肌細胞球的搏動頻率增加,，而普萘洛爾,、西沙必利和利多*因處理的心肌細胞球的搏動頻率降低。除了降低搏動頻率外,，西沙必利處理還破壞了心肌細胞球的搏動模式,。用鈣通道阻滯劑維拉帕米處理心肌細胞球可抑制鈣信號（圖 3b 和 4）。綜上所述,，結(jié)果與之前的研究一致5,，6。

圖 3. Peak Pro 分析算法,。（A） Peak Pro 分析算法允許自動計算峰值參數(shù),，包括峰值頻率、計數(shù)、振幅,、寬度（在10% 和 50%的 高度）以及間距,、上升時間、衰減時間和不規(guī)則間距,。（B） 使用心肌細胞跳動 i3（高級）程序在 SoftMax Pro 軟件中顯示計算出的峰值屬性,，。

圖 4. 心肌細胞球搏動模式,。 在 SoftMax Pro 軟件中,，對照 （DMSO） 和處理過的心肌細胞球的搏動模式在 30 秒的時間段內(nèi)以熒光強度圖直觀表示。頂部：對照（左）和維拉帕米（右）,。中間： 普萘洛爾（左）和西沙必利（右）,。底部：異丙腎上腺素（左）和利*卡因（右）。

結(jié)論

使用生物相關(guān),、基于細胞的模型進行高內(nèi)涵和高通量心臟毒性篩選檢測,，從而在開發(fā)的早期階段消除心臟毒性候選藥物，可大大減少藥物開發(fā)的時間和成本,。為了保持高通量和高內(nèi)涵篩選檢測的效率，需要同樣快速的數(shù)據(jù)分析,。SoftMax Pro 導(dǎo)入功能可用于 SoftMax Pro v6.4.1 或更高版本,，可實現(xiàn)從成像系統(tǒng)、實時 PCR 系統(tǒng),、非 Molecular Devices 讀板機,、閃爍計數(shù)器等各種科學(xué)儀器采集的微孔板格式數(shù)值數(shù)據(jù)分析?；?/span> Excel 和 XML 的兩種導(dǎo)入選項可提供從手動導(dǎo)入到全自動數(shù)據(jù)導(dǎo)入和分析的一系列自動化功能,。除了專門用于量化心肌細胞和心肌細胞球跳動等多峰振蕩數(shù)據(jù)的 Peak Pro 軟件算法和方案外，SoftMax Pro 的公式系統(tǒng)和語法助手還可幫助您獲得所需的結(jié)果,，包括 IC50 圖和條件通過/失敗結(jié)果,。可保存自定義操作規(guī)程以供重復(fù)使用,，無論數(shù)據(jù)源如何,，均可確保高效且一致的分析。

參考文獻

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