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【應用實例】線粒體動力學檢測和表型分析
引言
新陳代謝是生物體內(nèi)進行的化學變化的總稱,，是生物最基本的生命活動過程。細胞從環(huán)境汲取能量,、物質(zhì),，在內(nèi)部進行各種化學變化，維持自身高度復雜的有序結(jié)構(gòu),，保證生命活動的正常進行,。作為細胞的“能量工廠”，線粒體在維持能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用,，可以調(diào)控蛋白質(zhì),、脂質(zhì)、溶質(zhì)和代謝物產(chǎn)物的進出,，并保護細胞質(zhì)免受有害線粒體產(chǎn)物的影響,。線粒體通過不斷的分裂和融合，維持線粒體形態(tài),、分布和數(shù)量,，維持細胞穩(wěn)態(tài)，該過程被稱為線粒體動力學,。線粒體自噬是機體清除細胞內(nèi)功能異常的線粒體的過程,，是線粒體質(zhì)量控制的主要機制。線粒體動力學的病理改變可導致生物能量功能受損和線粒體介導的細胞死亡,，并與多種病理機制相關(guān),，包括缺血性心肌病，糖尿病,，肺動脈高壓,，帕金森氏病，亨廷頓氏病,，骨骼肌萎縮癥,、阿爾茨海默病等。
線粒體大小和形狀取決于它們在細胞內(nèi)的位置以及不同細胞對能量的需求,。當線粒體發(fā)生損傷時,，它的形態(tài)和完整性會發(fā)生改變,，如線粒體的數(shù)量、大小,、長度和形狀等,。線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的檢測對于了解線粒體的穩(wěn)態(tài)以及功能狀態(tài)有重要意義,。
高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)非常適合進行線粒體表型和結(jié)構(gòu)的研究,。共聚焦成像和水鏡可以提高成像質(zhì)量并更好地顯示線粒體結(jié)構(gòu)，高內(nèi)涵的圖像分析工具可以幫助科研工作者獲得不同表型的數(shù)字特征,，線粒體表型和結(jié)構(gòu)重排的分析模塊可用于線粒體動力學為基礎的細胞研究,。
結(jié)果展示：
使用不同濃度的化合物，包括氯喹（抑制線粒體循環(huán)）,，魚藤酮（氧化磷酸化抑制劑）和纈氨霉素（鉀離子載體）處理PC12（人神經(jīng)母細胞瘤細胞）,。將活細胞用線粒體染料MitoTracker Orange 和Hoechst 進行染色，利用ImageXpress®Micro Confocal 系統(tǒng)（Molecular Devices）進行成像,，使用共聚焦模式和40X水鏡拍攝活細胞的圖像,，分辨單個線粒體并檢測線粒體形態(tài)變化。使用 MetaXpress®高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的Custom Module Editor（自定義模塊編輯器）分析圖像,，使用“Granularity”模塊和“Find Fibers”模塊識別圓形顆粒和細長的線粒體（圖 1）,。
圖1 線粒體形狀的表型分析。
圖 2 化合物對線粒體的作用,。使用MitoTracker Orange對線粒體進行染色（ 黃色 ）,，對照組（A）、纈霉素（B）,、魚藤酮（C）,。
表1 用圖3所示的曲線定量 EC50
Molecular Devices高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)適用于各種細胞模型中化合物的藥物開發(fā)或毒性評估,。使用高內(nèi)涵成像和高級圖像分析的線粒體動力學分析方法不僅可以量化線粒體的表型變化，而且這種多參數(shù)方法也可用于研究正常和病理結(jié)構(gòu)變化以表征疾病模型或復合效應,。
主要特點：
• 獲得高質(zhì)量的圖像,，更好地顯示線粒體形狀和結(jié)構(gòu)的變化
• 以更有效、更精確的方式量化和測量線粒體的表型變化
• 了解疾病的機制并評估各種細胞模型中的化合物毒性
新陳代謝是生物體內(nèi)進行的化學變化的總稱,，是生物最基本的生命活動過程。細胞從環(huán)境汲取能量,、物質(zhì),，在內(nèi)部進行各種化學變化，維持自身高度復雜的有序結(jié)構(gòu),，保證生命活動的正常進行,。作為細胞的“能量工廠”，線粒體在維持能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用,，可以調(diào)控蛋白質(zhì),、脂質(zhì)、溶質(zhì)和代謝物產(chǎn)物的進出,，并保護細胞質(zhì)免受有害線粒體產(chǎn)物的影響,。線粒體通過不斷的分裂和融合，維持線粒體形態(tài),、分布和數(shù)量,，維持細胞穩(wěn)態(tài)，該過程被稱為線粒體動力學,。線粒體自噬是機體清除細胞內(nèi)功能異常的線粒體的過程,，是線粒體質(zhì)量控制的主要機制。線粒體動力學的病理改變可導致生物能量功能受損和線粒體介導的細胞死亡,，并與多種病理機制相關(guān),，包括缺血性心肌病，糖尿病,，肺動脈高壓,，帕金森氏病，亨廷頓氏病,，骨骼肌萎縮癥,、阿爾茨海默病等。
線粒體大小和形狀取決于它們在細胞內(nèi)的位置以及不同細胞對能量的需求,。當線粒體發(fā)生損傷時,，它的形態(tài)和完整性會發(fā)生改變,，如線粒體的數(shù)量、大小,、長度和形狀等,。線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的檢測對于了解線粒體的穩(wěn)態(tài)以及功能狀態(tài)有重要意義,。
高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)非常適合進行線粒體表型和結(jié)構(gòu)的研究,。共聚焦成像和水鏡可以提高成像質(zhì)量并更好地顯示線粒體結(jié)構(gòu)，高內(nèi)涵的圖像分析工具可以幫助科研工作者獲得不同表型的數(shù)字特征,，線粒體表型和結(jié)構(gòu)重排的分析模塊可用于線粒體動力學為基礎的細胞研究,。
結(jié)果展示：
使用不同濃度的化合物，包括氯喹（抑制線粒體循環(huán)）,，魚藤酮（氧化磷酸化抑制劑）和纈氨霉素（鉀離子載體）處理PC12（人神經(jīng)母細胞瘤細胞）,。將活細胞用線粒體染料MitoTracker Orange 和Hoechst 進行染色，利用ImageXpress®Micro Confocal 系統(tǒng)（Molecular Devices）進行成像,，使用共聚焦模式和40X水鏡拍攝活細胞的圖像,，分辨單個線粒體并檢測線粒體形態(tài)變化。使用 MetaXpress®高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的Custom Module Editor（自定義模塊編輯器）分析圖像,，使用“Granularity”模塊和“Find Fibers”模塊識別圓形顆粒和細長的線粒體（圖 1）,。
圖1 線粒體形狀的表型分析。
Molecular Devices高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)適用于各種細胞模型中化合物的藥物開發(fā)或毒性評估,。不同化合物處理會導致線粒體形態(tài)變化,，膜電位的損失、以及細胞的程序性死亡等,。MetaXpress軟件非常適合進行線粒體形態(tài)的測定，可以定義每個對象的數(shù)量,、面積,、強度、長度和形狀（表1,，2）,。使用具有共聚焦模式的40X 水鏡對細胞進行成像，MetaXpress 自定義模塊編輯器分析圖像（圖 2）,。這些檢測結(jié)果可以計算劑量反應和各種化合物的有效濃度,，以及用數(shù)字來表征線粒體結(jié)構(gòu)動力學（圖 3）。
圖 2 化合物對線粒體的作用,。使用MitoTracker Orange對線粒體進行染色（ 黃色 ）,，對照組（A）、纈霉素（B）,、魚藤酮（C）,。
使用特定濃度的化合物（氯喹,，魚藤酮和纈氨霉素）處理 PC12 細胞，對細胞進行染色和成像,。通過圖像分析將線粒體結(jié)構(gòu)確定為“纖維”(頂部) 或“顆粒”(中部),，底部為線粒體染色后熒光強度的變化。EC50的值取決于四個濃度依賴性復本和參數(shù)曲線的擬合（圖 3）,。
圖 3使用氯喹（綠色）,，魚藤酮（紅色）和纈氨霉素（藍色）處理 PC12 細胞。EC50的值取決于四個濃度依賴性復本和參數(shù)曲線的擬合,。
在分析過程中,，我們比較了水鏡和空氣鏡對圖像質(zhì)量和分析的影響。結(jié)果顯示,，使用水鏡可以提高圖像質(zhì)量,，并且通常會導致 Z' 值增加（ 表 3 ）。圖4顯示了使用自定義模塊編輯對線粒體表型進行計數(shù)和分析,，以評估線粒體的健康,、代謝、循環(huán),、復合效應和疾病狀態(tài)等,。并且，自定義模塊編輯可以針對特定的細胞類型或疾病模型進行進一步的調(diào)整和修改,。
表1 用圖3所示的曲線定量 EC50
表 2 不同的對照和化合物處理方法的比較,。上面四列數(shù)據(jù)分別是對照，10 um 的氯喹,，300 nm的魚藤酮,，和10 nm的纈氨酸霉素。
表 3 與空氣鏡相比,，水鏡可以提高圖像質(zhì)量,，獲得更高的Z’值。
總結(jié)：
Molecular Devices高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)適用于各種細胞模型中化合物的藥物開發(fā)或毒性評估,。使用高內(nèi)涵成像和高級圖像分析的線粒體動力學分析方法不僅可以量化線粒體的表型變化，而且這種多參數(shù)方法也可用于研究正常和病理結(jié)構(gòu)變化以表征疾病模型或復合效應,。
主要特點：
• 獲得高質(zhì)量的圖像,，更好地顯示線粒體形狀和結(jié)構(gòu)的變化
• 以更有效、更精確的方式量化和測量線粒體的表型變化
• 了解疾病的機制并評估各種細胞模型中的化合物毒性