簡介
novel coronavirus的出現(xiàn)導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的novel coronavirus大流行,，為了理解病毒的發(fā)病機理并開發(fā)疫苗，亟需快速開發(fā)多種研究工具,。檢測病毒感染和疫苗接種后的免疫反應(yīng)對novel coronavirus的研究十分重要,。由于中和抗體是免疫反應(yīng)和疫苗效價的關(guān)鍵生物標志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監(jiān)測有效性的重要參數(shù),。

人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統(tǒng)方法例如蝕斑減少中和試驗 (PRNT) 來檢測,。然而，該方法使用活的,、具備感染性的

病毒加入到靶細胞中,，所以需要生物安全三級實驗室以及耗時費力的細胞培養(yǎng)。數(shù)據(jù)結(jié)果的分析耗費時間并且不能自動化,。此外,，假病毒中和試驗 (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級實驗室完成,，但此方法需要細胞培養(yǎng)和熒光成像來測得中和抗體活性,，因此，也不適用于樣品的高通量篩選,。

此 GeneScript cPass

novel coronavirus中和抗體檢測試劑盒采用免病毒中和測試法 (sVNT) 來克服傳統(tǒng)的病毒中和實驗的缺點,。它采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 的模式，如圖 1 和圖 2 所示,。
優(yōu)勢
• 快速,、簡單的 ELISA 實驗流程設(shè)置

• 無需三級實驗室或細胞培養(yǎng)

• 實驗結(jié)果與蝕斑減少中和試驗數(shù)據(jù)一致

刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域的 HRP 偶聯(lián)片段與含有中和性抗體的患者血清樣本相結(jié)合。此混合物加入到已被 ACE2 受體包被

的 ELISA 孔板中,。如果樣品中的抗體有中和抗體的活性,，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的 結(jié)合將會被打破，隨后清洗，移 除HRP-RBD,。使用光吸收微孔板讀板機測量產(chǎn)生的信號,，在中和抗體存在的情況下，此信號會更低,，將此信號與實驗對照組的信號進行比較,，可以評估待測樣本中存在的中和抗體活性。

在 此,，替代的病毒中和實驗 (sVNT) 試劑盒的數(shù)據(jù)結(jié)果,，由SpectraMax 微孔板讀板機進行檢 測、SoftMax Pro 軟件進行分析得到,。這些結(jié)果與先前使用的傳統(tǒng)假病毒中和試驗(pVNT) 方法得到的結(jié)果密切相關(guān),，然而只需要一小部分地時間和更低的生物實驗室安全等級限制。

材料
• GenScript cPass novel coronavirus中和抗體檢測試劑盒 (GenScriptcat. #L00847-A),，

• 10 份血清樣本,，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗體陽性，

• 3 份血清樣本,，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗體陰性，

• MultiWash+ 微孔板洗板機 (Molecular Devices)

• 光吸收檢測模式用到的 Molecular Devices 酶標儀：

• SpectraMax ABS Plus 酶標儀

• SpectraMax iD5 多功能酶標儀

• SpectraMax i3x 多功能酶標儀

• SpectraMax M5e 多功能酶標儀

方法
在實驗開始前,，試劑盒的所有組分和待測樣本可放置于室溫,。試劑盒中的試劑需要按如下操作稀釋：

• 用去離子水稀釋 20x 儲液得到 1x wash，

• 用 HRP 稀釋緩沖液按 1:1000 比例稀釋 HRP-RBD 儲液得到HRP-RBD 工作液,。

待測樣本 和實驗對照組分別與 HRP 偶聯(lián)的 RBD 混合,，并按如下操作孵育。待測樣本,、陽性對照,、陰性對照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋,，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液,。將稀釋后的樣品和對照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +120uL 稀釋后的待測樣品或?qū)φ掌?。此混合物?37 度孵育15 分鐘,。

分別添加 100uL 的陽性對照混合物、陰性對照混合物樣品混合物至實驗復(fù)孔中,。然后封蓋,，在 37 度孵育 15 分鐘。

使用 MultiWash+ 洗板機和 1x wash 溶液清洗所有的微孔板,，每次每孔 300 uL,，橫向吸液。然后，100uL TMB 溶液加入到每個孔中,，封蓋,，避光，室溫孵育 15 分鐘,。與 TMB 底物孵育后,，50 uL 終止

、待測溶液加入到每個孔中,，立即在多款酶標儀上測讀,，光吸收波長設(shè)置為 450 nm。實驗結(jié)果的有效性評估看陰性對照的 OD450 值是否大于 1.0,，陽性對照的值是否小于 0.3,。如果不符合這些標準，實驗結(jié)果無效,，需要重復(fù)試驗,。

各個待測樣本的百分比抑制值按如下公式計算：

表 1 的卡值被用來說明樣本的結(jié)果是陽性還是陰性，是否存在可檢測到的

novel coronavirus中和抗體,。表中的卡值來源于novel coronavirus sVNT試劑盒手冊,。對于不同地區(qū)和種族背景，使用者可以直接基于具有代表性的患者血清樣本設(shè)置卡值,。

結(jié)果
使用陽性和陰性對照評估實驗結(jié)果的質(zhì)量,。如表 2 所示，陰性對照的 OD450 值大于 1.0,，陽性對照的 OD450 值小于 0.3,，

這是根據(jù) sVNT 試劑盒的質(zhì)量控制要求而定。

如方法中所描述,，待測樣本和陰性對照的 OD450 值用于計算百分比抑制值,。基于試劑盒手冊中一般的卡值特點,，百分比抑

制值大于等于 30% 說明檢測到

novel coronavirus中和抗體,，呈陽性；百分比抑制值小于 30% 說明未檢測到novel coronavirus中和抗體,，呈陰性,。在PRNT 中和活性檢測中呈陰性的三個樣品，在 sVNT 檢測中也呈陰性,。同樣地,，在 PRNT 中和活性檢測中呈陽性的十個樣

品，在 sVNT 檢測中也呈陽性 ( 如表 3),。

結(jié)論
此 GenScript cPass novel coronavirus中和抗體檢測試劑盒數(shù)據(jù)來源于一組患者血清樣本,，與傳統(tǒng)的、耗時費力的 PRNT 方法獲得的數(shù)據(jù)吻合。此 sVNT 試劑盒提供了易于使用的試劑和緊湊的 ELISA 工作流程,，大約 1 小時能夠完成,。其中必需的一步清洗操作由MultiWash+ 洗板機完成，節(jié)約了寶貴的時間,。SpectraMax 讀板機和 SoftMax Pro 軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠運用實驗特異的方案進行分析,，設(shè)置公式可以應(yīng)用于所需的計算和自動結(jié)果輸出。