簡介
基于圖像的表型分析方法，如廣泛使用的 Cell Painting分析,，使用高內涵成像和多參數(shù)輸出來研究細胞中的生物,、遺傳和化學擾動。這種日益流行的方法正被應用于從藥物發(fā)現(xiàn)項目到基因組篩選研究,。在標準的 Cell Painting 實驗中,，各種細胞器和結構 ( 細胞核,、細胞質,、線粒體、高爾基體,、內質網(wǎng),、細胞骨架、胞質 RNA 和核仁 ) 在 5 個成像通道中被采集,。這種廣泛的細胞染色能夠以單細胞分辨率對多種形態(tài)的擾動進行監(jiān)測和定量,。已發(fā)表的 Cell Painting 分析的局限性包括適合的染料可用性狹窄以及成像系統(tǒng)提供足夠的光譜分離能力。具體來說,，高爾基體和肌動蛋白是通過同一通道成像的,，這就給圖像分析中區(qū)分這兩個結構帶來了挑戰(zhàn)。這種限制可能會干擾 hit 的選擇或掩蓋某些化合物的效果,，特別是那些具有影響高爾基體 ( 生物合成途徑 ) 或細胞骨架網(wǎng)絡的作用機制 (MOA) 的化合物,。

優(yōu)勢
• 使用近紅外標記提高 Cell Painting 分析的靈敏度。

• 使用 IN Carta 的深度學習 SINAP 模塊獲得可靠的圖像分割,。

• 結合 StratoMineR 的基于云的數(shù)據(jù)分析軟件易于使用,。

在這里,，我們試圖利用配備近紅外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高內涵成像系統(tǒng)來改進檢測方法。我們將 Alexa Fluor 568 Phalloidin 替 換 為 Alexa Fluor 750 Phalloidin,，使細胞骨架與高爾基區(qū)域明顯分離,。

由于這種多色分析的復雜性，從這些圖像分析中產生的龐大數(shù)據(jù)需要額外的分析工具來幫助挖掘和解釋數(shù)據(jù),。為了便于管理圖像和數(shù)據(jù)分析,，我們使用 IN Carta 圖像分析軟件進行特征提取，然后使用 HC StratoMineR 進行數(shù)據(jù)挖掘和分析,。IN Carta 具有深度學習功能,，允許更可靠的特征分割。因此,，當與深度學習的 SINAP 模塊一起使用時,，Cell Painting 分析將受益于改進的細胞核檢測。此外,，如線粒體,、內質網(wǎng)、高爾基體和細胞骨架等細胞器可以在需要時使用深度學習功能進一步分割,?？梢詮姆治龅膱D像中提取包含熒光強度、空間數(shù)值,、紋理,、細胞器分布和共定位測量。然后將數(shù)據(jù)上傳到 HC StratoMineR,，這是一個直觀的基于云的數(shù)據(jù)分析平臺,，用于進一步的數(shù)據(jù)分析。為了確定我們的方法是否比標準的 Cell Painting方法有任何優(yōu)勢,，我們比較了用 5 通道獲得的圖像和用 6通道獲得的圖像之間的表型距離得分,。我們發(fā)現(xiàn)，用一組化合物處理的細胞的距離得分提高了49%,。這些結果表明,，對高爾基體和細胞骨架使用單獨的成像通道增加了 Cell Painting 實驗的敏感性，并更有力的代表了不同的細胞表型特征,。

方法
1. U2OS 細胞 (ATCC) 以每孔 2000 個細胞接種,。

2. 在四個復孔中，以 7 個數(shù)據(jù)點 1:3 系列稀釋和合適的對照品對 11 種化合物進行了測試,。使用的化合物 :Ca-074-Me,、CCCP、細胞松弛素 D,、拉春庫林 B,、雷帕霉素,、魚藤酮、十字孢堿,、粉防己堿,。

3. 細 胞 染 色 采 用 Bray 等 人 的 方 法

1。對 于 改 進 的 方案,，使 用 phalloidin/Alexa Fluor Plus 750 (ThermoFisher) 代替 phalloidin/Alexa Fluor 568,。

4. 圖像采集在使用 20X Plan Apo 物鏡的 ImageXpressConfocal HT.ai ( 基于激光 ) 或者 ImageXpress MicroConfocal ( 基于 LED) 的高內涵成像系統(tǒng) (MolecularDevices) 上進行。 使用的濾光片如表 1 所示,。

5. 圖像分析采用 IN Carta 圖像分析軟件,。所選擇的測量包括與強度、紋理,、形狀,、空間關系和共定位分數(shù)相關的參數(shù)。

6. 細胞水平的數(shù)據(jù)被上傳到 StratoMineR進行進一步的數(shù)據(jù)分析,。 簡要地說,，采用了質量控制、孔歸一化,、數(shù)據(jù)轉換和特征標準化,。使用主成分分析(PCA) 對數(shù)據(jù)集進行降維。進一步的下游分析,，如進行基于主成分和表型距離得分的 hit 選擇和聚類分析,。

結果
圖像采集
Cell Painting 實驗使用六種熒光標記同時標記細胞，然后對各種細胞結構進行成像,。高爾基體 ( AGP 通道 ) 和細胞骨架均使用相同的濾光片組成像 ( 表 1,，圖 1 )。這些亞細胞結構的解析通常在圖像分析步驟中進行,。在我們的模型實驗中,，用 11 種化合物處理 U2OS 細胞 24 小時，然后再根據(jù)之前發(fā)表的方法進行,。 1、2 然后使用 5 個成像通道對細胞進行成像 ( 圖 1 ),。

為了從細胞骨架中分離出高爾基體結構,，我們修改了檢測方法，將 Alexa Fluor 568 Phalloidin 換成 Alexa Fluor 750Phalloidin,，并使用配備了近紅外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高 內 涵 成 像 系 統(tǒng) 對 細 胞 進 行 成 像 ( 圖2A ) ( 以下簡稱改進的檢測 ),。用這種方法，可以在未經處理的細胞中清楚地看到高爾基體結構在核周分布,。當WGA( 高爾基體 ) 和鬼筆環(huán)肽 ( 肌動蛋白 ) 染色在同一通道成像時,，這種分布不易區(qū)分 ( 圖 1 ),。這種差異在化合物( 如粉防己堿 ) 處理的細胞中更為明顯 ( 圖 2B )。

特征提取和數(shù)據(jù)分析
為了量化標準 cell paint 染料組與改良染料組染色的細胞之間的差異,，在 IN Carta 圖像分析軟件中分析圖像 ( 圖3 ),。提取的測量數(shù)據(jù)上傳到 HC StratoMineR 進行進一步的數(shù)據(jù)分析。從標準 Cell Painting 實驗與改良實驗提取的數(shù)據(jù)執(zhí)行主成分分析 (PCA),。有趣的是,，AGP 通道的測量構成了 PCA 1 中 5 通道圖像的大部分特征成分。然而,，肌動蛋白通道的測量構成了 PCA 1 中改良后的 6 通道圖像的大部分主要特征 ( 圖 4 ),。這表明，改進的分析方法可以提高肌動蛋白和高爾基體組分之間的表型圖譜的分辨

率,，這對了解 MOA 是有用的,。

我們還根據(jù)距離評分比較了標準和改良 Cell Painting 實驗之間的表型特征。該分數(shù)表示一個樣本與陰性對照之間的表型距離,，可用于篩選實驗中的 hit 選擇,。我們發(fā)現(xiàn)已知影響高爾基體通路的化合物的距離分數(shù)有所增加( 表 2 )。這些結果明,，對高爾基體和細胞骨架使用單獨的成像通道增加了 Cell Painting 實驗的敏感性,，并更有力地代表了細胞表型特征。

總結
• 我們的結果表明,，使用近紅外激光提高了 Cell Painting檢測的靈敏度,。在這種情況下，它允許開發(fā)一種分離高爾基體表型更敏感的分析方法,。

• 額外的通道還允許通過添加項目特定的生物標記物來擴展標準的 Cell Painting 分析,。