【應(yīng)用文章下載】SNP基因分型高通量檢測方法新思路Molecular Devices

時間：2018-5-11 閱讀：1249

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SNP基因分型高通量檢測方法新思路
單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,，SNP），主要指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,。它是人類可遺傳的變異中zui常見的一種,，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個,，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多,。單核苷酸多態(tài)性是基因組上單個核苷酸的變異，包括置換,、顛換,、缺失和插入。近年來,，單核苷酸多態(tài)性研究備受關(guān)注,。由于個體間核苷酸序列存在很大差異，SNP的數(shù)量幾乎是無限的,，且每個SNP可能是潛在的有用標(biāo)記,。SNP標(biāo)記的潛力已在人類基因分型中得到很好的展示。雖然此技術(shù)廣泛應(yīng)用于人類和動物基因組分析,，但在植物上仍處于起步階段,，目前在水稻、玉米,、大豆等作物研究中應(yīng)用較多,。研究表明，作物基因組序列均含有豐富的SNP,，對其進行SNP研究,，有利于揭示作物生長發(fā)育規(guī)律，而新的檢測技術(shù)也促進了以SNP 為核心的高通量基因分型技術(shù)的發(fā)展,，極大地推動了農(nóng)作物在遺傳,、種質(zhì)鑒定和功能基因的克隆與鑒定、分子育種等方面的研究,。隨著SNP研究的日益增多，相關(guān)的檢測技術(shù)也層出不窮,，競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR,，KASP）便是其中之一，可在廣泛的基因組DNA 樣品中（甚至是一些復(fù)雜基因組的DNA 樣品）,，對SNP和特定位點上的插入,、缺失進行的雙等位基因判斷，此方法利用2個熒光探針,、2個通用淬滅探針,，再加多個位點特異探針來檢則多個SNP位點，原理上類似Taqman檢測,，也是基于終端熒光讀取判斷,，每孔采用雙色熒光檢測一個樣本的一個位點可能的兩種基因型，但與Taqman技術(shù)不同的是,，它不需要每個SNP位點都去合成特異的熒光引物,，基于自己的ARM PCR原理,，讓所有的位點檢測zui終都使用通用熒光引物擴增，大大降低了KASP的試劑成本,，比Taqman具有更好的位點適應(yīng)性,，所以在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)檢測方面都有非常好的應(yīng)用,。 KASP方法的樣品一般可放于多孔板中如*96孔板,，非常適合在具有熒光檢測功能的酶標(biāo)儀上進行熒光信號的讀取，以下便是在SpectraMax i3x和SpectraMax M5e酶標(biāo)儀中讀取KASP樣品產(chǎn)生的熒光信號后所繪制的散點圖：


上左圖：FAM,、HEX和兩者的混合物的相對熒光強度與ROX進行標(biāo)準(zhǔn)化且標(biāo)準(zhǔn)化值在SoftMax Pro軟件中繪制散點圖,。如圖所示，得到了三個不同的集群,。上右圖：ROX標(biāo)準(zhǔn)化的DNA擴增樣品熒光在SoftMax Pro軟件中繪制散點圖,。三個顯著的集群被檢測出來。FAM純合子位置靠近X軸,，而HEX純合子則位置靠近Y軸,，包含F(xiàn)AM和HEX的雜合樣品所形成的的集群在兩個純合子集群之間。無模板對照形成的集群靠近坐標(biāo)0點位置,。所得數(shù)據(jù)與供應(yīng)商驗證試劑盒基因分型結(jié)果高度一致,。

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