準(zhǔn)備細(xì)胞:
1,、檢查并確認(rèn)細(xì)胞沒有真菌,、細(xì)菌、支原體污染,。
2,、凍存前的細(xì)胞處于對數(shù)生長期最佳。
3,、計(jì)數(shù)待凍存的細(xì)胞數(shù)量,。懸浮細(xì)胞應(yīng) 180g 離心 5~10min 后除去培養(yǎng)基,貼壁細(xì)胞應(yīng)消化后計(jì)數(shù),,再 180g 離心除去培養(yǎng)基以獲得細(xì)胞沉淀,。
細(xì)胞凍存:
1、首先確定細(xì)胞適宜的凍存密度和體積,,計(jì)算應(yīng)使用的本凍存液體積,。
注意:可使用的凍存密度為 2~40×106 /ml,最佳密度為 4~20×106 /ml,。凍存體積為 0.25~1ml/管,,推薦凍存體積為 0.5ml/管。
2,、吸取適量 凍存液 重懸細(xì)胞,,立即分裝至細(xì)胞凍存管。
3,、立即將凍存管移入-80℃低溫冰箱,,不能采取任何程序降溫措施或使用程序降溫裝置。如果無法立即移入-80℃低溫冰箱,,至少應(yīng)當(dāng)先移入 0℃以下環(huán)境中(如-20℃冰箱)短暫存放 10 min 左右,,同樣不能采取程序降溫。凍存液重懸后的細(xì)胞不能在室溫或 2~8℃靜置超過 10 min 以上,。
4,、-80℃冰箱過夜后的凍存管,要立即移入液氮中儲(chǔ)存,,不可于-80℃長期凍存,。
細(xì)胞復(fù)蘇:
1,、先準(zhǔn)備室溫或 37℃預(yù)溫的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其體積為凍存液體積的 15~30 倍,。
2,、取出液氮中的凍存管,置于 37℃水浴并不斷輕搖,。待剩余 1 粒米大小的冰塊時(shí),,迅速移出水浴。3,、立即用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液,,輕柔吹打 3~5 次混勻。然后,,180g 離心 5~10 分鐘,,獲得細(xì)胞沉淀備用。
4,、加入適量新鮮培養(yǎng)基,,使用移液管緩慢懸浮細(xì)胞,并將細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶中,,顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5,、24h 后觀察細(xì)胞狀態(tài),,并更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。