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TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit（FITC）細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特點(diǎn)是細(xì)胞染色體 DNA 的降解,， 這是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象,。這種降解非常特異并有規(guī)律,，所產(chǎn)生的不同長(zhǎng)度的 DNA 片段約為 180 bp-200 bp 的整數(shù)倍,， 表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜，本試劑盒采用 TUNEL 法,，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡細(xì)胞斷裂 DNA 的 3′-OH 末端催化摻入 FITC-dUTP ,。 FITC-dUTP 標(biāo)記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細(xì)胞儀定量。TUNEL 法可以選擇性的檢測(cè)凋亡細(xì)胞,，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞,。TUNEL 實(shí)驗(yàn)中， TdT 酶催化 dUTP 摻入 斷裂的 DNA 鏈的 3′-OH 末端,?？乖瓨?biāo)記的 dUTP（如 digoxin-dUTP、生物素-dUTP）,，因?yàn)樗梢灾苯舆M(jìn)行原位檢測(cè),，是一種更快速、直接的檢測(cè)手段,。

TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit（FITC）實(shí)驗(yàn)材料（自備） 
PS 緩沖液（pH~7.4） 
4%多聚甲醛（in PBS） 
牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊,、牛血清 
70%乙醇（自選） 
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本） 
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、樣本準(zhǔn)備： 
1.1 細(xì)胞樣品
1) 可選：準(zhǔn)備一份陰性對(duì)照樣本（加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反應(yīng)液）,。
2) PBS 清洗細(xì)胞兩次,。 
3) 細(xì)胞固定：加入適量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃ 放置 30 min,。 
4) PBS 清洗細(xì)胞兩次,。 
5) 通透細(xì)胞：加入冰上預(yù)冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h,。 細(xì)胞能在 70%乙醇中-20℃的條件下保存一周,。或者細(xì)胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,，室溫放置 20 min,。 
6) PBS 清洗細(xì)胞兩次。 
1.2 石蠟組織切片
1) 室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片 2 次,，每次 5 min,，以*脫掉石蠟,。 注：二甲苯有毒，易揮發(fā),，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中進(jìn)行此操作,。 
2) 室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗 2 次,，每次 5 min,。 
3) 室溫下，將切片樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的乙醇 （95%,、90%、80%,、70%）中,，每種濃度各漂洗 1 次，每 次 5 min,。 
4) 室溫下,，將切片浸沒于純水中漂洗 1 次，每次 3 min,，再將切片浸沒于 1×PBS 中漂洗 1 次,，每次 3 min，用濾紙小心 吸干切片樣本周圍多余液體,。 
5) 用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓,，以便下游通透與標(biāo)記。 
6) 按 1:100 的比例,，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀釋,，使其終濃度為20 µg/mL。每個(gè)樣本上滴加100 µL 稀釋好的 Proteinase K 溶液,，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域,，室溫孵育 20 min。（Proteinase K 的孵育時(shí)間,、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）,。 
注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，但延長(zhǎng)孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切片脫落,，所以要*化孵育時(shí)間長(zhǎng)短,。時(shí)間一般為 10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min,，但 30 µm 左右的可用 30 min,。過長(zhǎng)易脫片、過短起不到通透效果,。 
7) PBS 浸潤(rùn)清洗切片兩次,，每次 5 min,，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤(rùn),。 
注：這一步必須把蛋白酶 K 洗滌干凈,，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后 續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。 
1.3 冰凍組織切片
1) 將冰凍切片放置于室溫的片架上,，室溫 20 min,，晾干。 
2) 將載玻片浸沒在 4%多聚甲醛溶液（in PBS）中,，室溫固定 30 min,。 
3) PBS 浸潤(rùn)清洗切片兩次，每次 5 min,。 
4) 用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。 
5) 按 1:100 的比例，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀釋,，使其終濃度為20 µg/mL,。每個(gè)樣本上滴加100 µL 稀釋好的 Proteinase K 溶液， 使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域,，室溫孵育 10 min,。Proteinase K 的孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）,。 注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織,，但延長(zhǎng)孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切片脫落，所以要*化孵育時(shí)間長(zhǎng)短,。時(shí)間一般為 10~30 min,，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右 的可用 30 min,，需摸索最佳時(shí)間,。過長(zhǎng)易脫片、過短起不到通透效果,。 
6) PBS 浸潤(rùn)清洗切片兩次,，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體,，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤(rùn),。 
1.4 陽(yáng)性處理(僅陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行TUNEL 反應(yīng)步驟)
1) 按 1:10 的比例用 ddH2O 將 10 × DNase I Buffer 稀釋成 1 × DNase I Buffer 備用,。 
2) 滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的樣本上,，室溫平衡 5 min。 
3) 用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀釋 DNase I (2 U/μL),， 使其為終濃度 20 U/mL 的工作液,。 
4) 輕輕吸掉多余液體,，加入 100 μL 濃度為 20 U/mL DNase I 工作液，室溫孵育 10 min,。 
5) 輕輕吸掉多余液體,，PBS 清洗樣品 2 次。 
2. TUNEL 反應(yīng) 
1) 每個(gè)樣本加入 100 μL TUNEL 平衡緩沖液,，孵育 5 min,。 
2) 預(yù)先配制 TUNEL 反應(yīng)混合液：每個(gè)樣本需要已加入 1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反應(yīng)緩沖液。 
3) 棄去平衡緩沖液,，用濾紙小心吸去切片樣本周圍的多余液體,，每個(gè)樣本加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液。 
a) 貼壁細(xì)胞,，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本,。37℃避光孵育 60 min。 
b) 懸浮細(xì)胞,，可加入微孔板中，采用微孔板振蕩器進(jìn) 行孵育或每隔 15 min 溫和的震蕩反應(yīng)管,，使之充分反應(yīng),。 37℃避光孵育 60 min。 
c) 組織樣本,，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本,。將樣本平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育 2 小時(shí),，濕盒底部鋪一張含少量水的紙巾保持濕度,。37℃避光孵育 2 h。 
4) 去掉反應(yīng)液,，在 1×PBS 的染色缸中浸泡潤(rùn)洗 2 次,，每次 5 min。再使用適量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,，其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本 3 次,，每次 5 min，以降低背景,。
5) （可選）復(fù)染：每個(gè)樣本滴加濃度為 2 μg/mL 的 DAPI 染液,，避光室溫孵育 10 min。染色完后,，輕輕去掉染液,，并將樣本在 1×PBS 中浸泡潤(rùn)洗 3 次，每次 5 min,。 
6) （可選）封片：將切片樣本先純水浸沒 5 min,，再放入 70%乙醇浸沒 5 min,，再 80%乙醇浸沒 5 min，90%乙醇浸沒5 min,，95%乙醇浸沒 5 min,，無水乙醇浸沒 5 min，最后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡透明化處理 2 次,，每次 5 min,。（通風(fēng)廚中操作）。脫水完成后,，擦去切片周圍的液體,，每個(gè)切片樣本滴加 50 μL 抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片,，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片,，去除氣泡以使封片*。 
7) 用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀觀察,、分析,，F(xiàn)ITC是一種綠色熒光染料，激發(fā)波長(zhǎng),、發(fā)射波長(zhǎng)分別為 485 nm,，515 nm （凋亡細(xì)胞應(yīng)被標(biāo)記上明亮的綠色熒光，沒有加入 TdT 酶的陰性對(duì)照樣本未被標(biāo)記上熒光）,。

1,、熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請(qǐng)盡量注意避光,，以減緩熒光淬滅,。
2、為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴口罩,、手套操作，接觸皮膚,，請(qǐng)立即用大量水沖洗,。

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒-FITC

本產(chǎn)品應(yīng)置于-20℃儲(chǔ)存，組分B需避光,，避免反復(fù)凍融,。