使用方法 | 細胞漿,、細胞核及細胞膜蛋白抽提試劑盒實驗流程: 1、試劑準備 1.1準備溶液 1.1.1室溫融解試劑盒中的各種溶液,,溶解后除結構蛋白提取液外,,其他試劑立即置于冰上; 1.1.2 結構蛋白提取液溶解后,,可放置于37℃水浴中溫浴至透明后,,常溫放置。 1.2蛋白提取工作液的準備 1.2.1胞漿蛋白提取工作液的準備:臨用前,,根據處理樣品的量估算實驗時胞漿蛋白提取液的需要量,,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。 1.2.2胞核蛋白提取工作液的準備:臨用前,,根據處理樣品的量估算實驗時胞核蛋白提取液的需要量,,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。 1.2.3膜蛋白提取工作液的準備:臨用前,,根據處理樣品的量估算實驗時膜蛋白提取液的需要量,,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。 1.2.4 結構蛋白提取工作液的制備:臨用前,,根據處理樣品的量估算實驗時結構蛋白提取液的需要量,,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。
2、對于培養(yǎng)細胞樣品: 2.1胞漿蛋白提取 2.1.1加2.0ml(2.0×107細胞 )的胞漿蛋白提取工作液,,在4℃條件下震蕩20分鐘,; 2.1.2準備1-5ml的注射器,用注射器吹打步驟1震蕩過的溶液50-90次,,在4℃條件下,,15000g離心10分鐘,。取上清液存于EP管中,,即為胞漿蛋白; 2.2胞核蛋白的提取取 2.1.2步驟獲得的沉淀物加入4.0ml/20million cells冰浴的胞漿蛋白提取工作液,,在4℃條件下震蕩5分鐘,,4℃條件下15000g離心10分鐘,棄去上清液,,沉淀物中加入1.0ml/20million cells冰凍的胞核蛋白提取工作液, 在4℃條件下震蕩5分鐘,,4℃條件下15000g離心10分鐘,上清液為細胞核蛋白,,轉入EP管并保存,; 2.3胞膜蛋白的提取在步驟2.2中的沉淀物中加入1.0ml/20million cells冰凍的膜蛋白提取工作液, 在4℃條件下震蕩5分鐘,4℃條件下15000g離心10分鐘,,上清液為細胞膜蛋白,,轉入EP管并保存。 2.4結構蛋白的提取在步驟2.3的沉淀物中加入常溫或37℃水浴過的透明的結構蛋白提取工作液 0.5ml/20million cells, 4℃條件下震蕩5分鐘,,4℃條件下15000g離心10分鐘,,保存上清液即為細胞骨架蛋白; 2.5待測蛋白的保存待檢測濃度的蛋白存于-70℃,。
3.對于組織樣品: 3.1胞漿蛋白提取 3.1.1加2.0ml/g的胞漿蛋白提取工作液,在4℃條件下研磨,,重復勻漿兩次,至全部溶解,; 3.1.2在4℃條件下,,震蕩5分鐘,18000g離心10分鐘,。取上清液存于EP管中,,即為胞漿蛋白,沉淀物繼續(xù)實驗,; 3.2胞核蛋白的提取在步驟3.1.2中的沉淀物中加4.0ml/g的胞漿蛋白提取工作液,在4℃條件下震蕩5分鐘,,4℃條件下18000g離心10分鐘,棄去上清液,;沉淀物中加1.0ml/g冰凍的胞核蛋白提取工作液, 在4℃條件下震蕩5分鐘,,4℃條件下18000g離心10分鐘,上清液為細胞核蛋白,轉入EP管并保存,; 3.3胞膜蛋白的提取在步驟3.2中的沉淀物中加1.0ml/g冰凍的膜蛋白提取工作液, 在4℃條件下震蕩5分鐘,,4℃條件下18000g離心10分鐘,上清液為細胞膜蛋白,,轉入EP管并保存,; 3.4結構蛋白的提取 3.4.1在步驟3.3中的沉淀物中加入常溫或37℃水浴過的透明的結構蛋白提取工作液0.5ml/g,震蕩5分鐘,,4℃條件下18000g離心10分鐘,,保存上清液; 3.4.2在3.4.1步中的沉淀物中加1.5ml/g冰凍的胞漿蛋白提取工作液, 在4℃條件下震蕩5分鐘,,4℃條件下18000g離心10分鐘,保存上清液,; 3.4.3混合前兩步的上清液,此為骨架蛋白,; 3.5待測蛋白的保存:待檢測濃度的蛋白存于-70℃,。 |
注意事項 | 1,、為取得最佳的使用效果,盡量避免過多的反復凍融,。建議可適當分裝后使用,; 2、所有接觸樣品的用具及試劑均需預冷,。裂解蛋白的所有步驟都需在冰浴或4℃進行,; 3、試劑盒50T是按照6孔板的單孔細胞量計算,,實際使用中本套試劑足夠處理5g組織,,或者1.25×108細胞,最少細胞不宜少于0.1g組織或者2.5×106,。 4,、結構蛋白提取液含有SDS,使用中如有沉淀水浴加熱溶解即可。 為了您的自身安全,,使用試劑前,,請做好防護,如穿實驗服,,帶手套等,。 |