使用磷酸化抗體時(shí),，需要注意以下事項(xiàng)以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性：
樣本處理：
加入抑制劑：在裂解緩沖液（lysis buffer）中必須加入蛋白酶抑制劑和適量的磷酸酶抑制劑,，以抑制組織或細(xì)胞裂解過(guò)程中釋放的內(nèi)源性蛋白磷酸酶,，防止磷酸化蛋白去磷酸化，從而維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài),。
確保裂解：建議使用裂解液裂解結(jié)合超聲處理,，確保細(xì)胞充分裂解并剪切染色質(zhì)DNA。超聲處理時(shí)應(yīng)保持低溫,，避免蛋白降解,。
新鮮樣本：使用新鮮制備的樣本，避免反復(fù)凍融,，以減少磷酸基團(tuán)的降解,。
抗體孵育：
低溫孵育：一抗孵育最好在4°C下進(jìn)行，并過(guò)夜孵育,，以確?？贵w與目的蛋白充分結(jié)合。低溫有助于維持抗體與抗原的物理吸附,，防止高溫下抗原脫落,。
稀釋液選擇：根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦的稀釋液稀釋抗體，通常建議使用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST稀釋液,，而非含脫脂牛奶的TBST,，因?yàn)槊撝Ｄ讨锌赡芎辛姿峄鞍祝绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果,。
洗滌條件：
洗滌液選擇：推薦使用TBST作為洗滌液,，相對(duì)于PBST，TBST能提供更強(qiáng)的信號(hào),。
洗滌次數(shù)和時(shí)間：洗滌次數(shù)和時(shí)間需要優(yōu)化,，以避免信號(hào)減弱或背景增加。通常建議一抗和二抗孵育后,，用TBST洗膜3次,，每次5分鐘。
封閉條件：
封閉劑選擇：雖然網(wǎng)絡(luò)上流傳磷酸化抗體不適于用牛奶封閉的說(shuō)法,，但使用實(shí)驗(yàn)級(jí)脫脂牛奶進(jìn)行室溫封閉1小時(shí)是有效的,，且有助于降低非特異性結(jié)合。
封閉時(shí)間：避免膜封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，以免掩蓋抗原表位,，阻止抗體結(jié)合。
對(duì)照設(shè)置：
陽(yáng)性對(duì)照：設(shè)置合適的陽(yáng)性對(duì)照,，以確認(rèn)抗體檢測(cè)到的特異性信號(hào),。
總蛋白和內(nèi)參對(duì)照：除了檢測(cè)磷酸化蛋白外，還應(yīng)檢測(cè)該蛋白的總表達(dá)量,，以及使用普通內(nèi)參作為體系對(duì)照,，保證上樣量一致,。
實(shí)驗(yàn)環(huán)境：
低溫環(huán)境：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除超聲處理外,，應(yīng)保持低溫環(huán)境,，以防止磷酸化蛋白在室溫下被蛋白磷酸酶降解,。
結(jié)果分析：
分子量比對(duì)：在壓片后,，根據(jù)marker比對(duì)條帶的分子量，確認(rèn)檢測(cè)到的條帶是否正確,。
曝光時(shí)間：優(yōu)化曝光或壓片時(shí)間,，以避免背景過(guò)深或條帶過(guò)淺。
抗體質(zhì)量：
選擇高質(zhì)量抗體：確保使用的磷酸化抗體質(zhì)量可靠,，并嚴(yán)格按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,。
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