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三,、人神經(jīng)干細胞培養(yǎng)方法

準(zhǔn)備神經(jīng)干細胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基

1、NSCwan全培養(yǎng)基需要補充NSC補充劑,、L-丙氨酰-谷氨酰胺,。

2、在無菌環(huán)境中,，依次將20mL NSC補充劑和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM終濃度）加入到含有480mL NSC培養(yǎng)基中,，此時即得神經(jīng)干細胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基(abs9821)。

3,、（可選）在培養(yǎng)基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-鏈霉素）溶液,。

注意：在所有成分的有效期限內(nèi)，在2°C至8°C的黑暗環(huán)境中儲存,，可穩(wěn)定長達4周,。

注意：可選擇添加200μM抗壞血酸，特別是懸浮培養(yǎng),。

包被孔板

1,、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410),，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底,，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min,。如果暫時不用,，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內(nèi)使用,。

2,、在使用前，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉,，然后加入預(yù)熱的wan全NSC培養(yǎng)基,。

NSC傳代

1、當(dāng)細胞密度達到90-100%的融合度時,，丟棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,。

2、用5mL不含鈣和鎂的預(yù)溫DPBS洗滌細胞,，然后吸棄溶液,。

3、在每個培養(yǎng)瓶中加入1.0mL預(yù)熱的人多能干細胞消化液(abs9409),，然后在室溫下孵育2-5min,。在孵育前確保wan全覆蓋細胞。

4,、用倒置顯微鏡觀察細胞是否脫離,。如有必要，輕拍培養(yǎng)瓶以促進細胞脫離,。

5,、輕輕上下移液，使團塊分散到單個細胞懸液中,。

6,、加入9mL預(yù)熱好的NSC wan全培養(yǎng)基停止細胞解離反應(yīng)，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,。

7,、200×g離心4min。

8,、丟棄上清,，然后用適量NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。

9,、用自動細胞計數(shù)器測定總活細胞密度,。

10、從每個覆蓋層培養(yǎng)瓶中除去覆蓋層溶液,，然后加入5mL預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基,，添加Y27632（終濃度10μM）。

11,、在每個培養(yǎng)瓶中加入5×10⁴細胞/cm²(例如,，1.25×10⁶細胞/T-25培養(yǎng)瓶)，然后混合或旋轉(zhuǎn)細胞懸液以確保均勻分布,。

12,、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育,。

注：為了獲得最佳性能和細胞生長,，每2-3天更換一次培養(yǎng)基,，用新鮮的預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基。

NSC凍存

1,、準(zhǔn)備干細胞凍存液(abs9412),。

2、按照“NSC傳代"中的步驟1至步驟7收集細胞進行冷凍保存,。

3,、在離心過程中，計算細胞密度為2×10⁶個活細胞/mL所需的最終體積,。

注：接下來的步驟需要半體積的室溫NSC培養(yǎng)基和半體積的凍存液,。

4、丟棄上清,，然后用NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞,。

5、加入等量的凍存液,，使終濃度為10%DMSO,。

6、立即將細胞懸液等分放入凍存瓶中（1mL/瓶）,。

7,、按照標(biāo)準(zhǔn)程序（每分鐘降低1°C）在自動或手動控制速率的冷凍設(shè)備中實現(xiàn)低溫保存。

8,、將冷凍細胞轉(zhuǎn)移到液氮中,。

NSC復(fù)蘇

1、在37°C水浴中迅速(<2min)解凍細胞,。

2,、用移液管將凍存液全部移入無菌的15mL離心管中。

3,、小心滴加（每秒1滴）,，加入4mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基，然后輕輕旋轉(zhuǎn)離心管混合,。

4,、繼續(xù)添加預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基至10mL。

5,、200×g離心4min,，確認(rèn)細胞沉淀，丟棄上清,。

6,、加入5mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，然后添加Y27632（終濃度10μM），再將離心管的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到包被的組織培養(yǎng)瓶中,。

7,、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育,。

8,、復(fù)蘇后24h用新鮮的預(yù)熱過的NSC wan全培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

注：為了恢復(fù)在NSC中生長的細胞,，我們建議在初始傳代時以≥1×10⁵個細胞/cm²的密度接種細胞。

四,、人神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)形成腦類器官

原代

一,、準(zhǔn)備工作

1、儀器設(shè)備

CO₂培養(yǎng)箱,、雙人單面超凈臺,、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機,、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床,、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱,、移液器（一套）,。

2、劑耗材（以腸癌為例）

動物腦類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs90050),、基質(zhì)膠（低因子,、無酚紅）(abs9495)、15mL離心管(abs7102),、1.5mL EP管若干(abs7119),、24孔細胞培養(yǎng)板(abs7035)、金屬冰盒,。

二,、操作流程

1、加膠-點板-加液（這里是整個原代操作的點睛之筆）

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化,；

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存,，建議2周內(nèi)用完,。

低溫金屬冰盒(abs7289)

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細胞團混合物,，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

干細胞團沉淀

消化收集神經(jīng)干細胞團到15mL離心管,，于300g 4℃富集離心5min后移去上清。

密度建議1：基質(zhì)膠體積：細胞團沉淀體積=25:1（如果估摸細胞團沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板,。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后,，加膠,，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng),。大概10-14天,，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作,。

鋪板密度

胎羊及胎鼠類器官生長圖

傳代（消化分兩種情況）

一,、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5孔為一組）,。

2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除）,，4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強,，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）,。

3）接下來將離心管進行300g,，4℃，離心5min,，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可,。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān),。此時棄掉緩沖液,，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟,，再次冷化離心,，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層,、類器官沉淀層）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層）,，此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離,；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時間可適當(dāng)加長（最常不超過10min）,。

2,、類器官消化

1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次,。此步驟以消化成細胞團為主,，千萬不要消化成單細胞，單細胞類器官存活率低,。如果不確定是否消化適宜,，可吸取數(shù)微升鏡下觀察，如果有較多細胞團可停止消化,。

2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化,，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留，殘留量<50uL正常,，不影響傳代類器官增殖）

3,、加膠-點板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時,；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完,。

（2）接種要求

24孔板(abs7035),，每孔25uL基質(zhì)膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如,，24孔板收集5孔,，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250uL

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是,，密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠,，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板,。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后,，加膠,，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基 A進行培養(yǎng),。大概10-14天,，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進行傳代操作,。

二,、類器官數(shù)量不足或體積較小時：

1、類器官收集,、吹打,、洗滌

1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠,。

2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣鏡下觀察有較多細胞團時可停止吹打）,；

3）洗滌： 24孔板,，每5孔為一組，收集在15mL離心管中,，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除）,，4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強,，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時,，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）,。

4）接下來將離心管進行300g，4℃,，離心5min,，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留細胞團沉淀即可。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時棄掉緩沖液,，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心,，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細胞團混懸液層）,，此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細胞團混懸液，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要,，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g）,，離心時間可適當(dāng)加長（最常不超過10min）。

2,、加膠-點板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化,；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時,；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存,，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035),，每孔25uL基質(zhì)膠細胞團混合物,，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 對于類器官數(shù)量較少的情況,，為了維持生長所需的旁分泌信號，需要2-3孔富集到1孔,，例如,，24孔板收集6孔，2孔富集1孔,，鋪3孔,，需要的基質(zhì)膠量25*3=75uL

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2,，如果有殘留的基質(zhì)膠,，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行,。操作熟練以后,，加膠，混勻,，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基 A進行培養(yǎng),。大概7-10天，多數(shù)類器官直徑在200-300um,，可進行再次傳代,。

凍存

凍存要領(lǐng):

類器官不需要消化（消化后的類器官復(fù)蘇活率低）；

在類器官指數(shù)增長期凍存（等到該傳代的時候類器官活性比指數(shù)期差）,，也就傳代后的Day3-Day4,，多數(shù)類器官直徑在100um-200um，這個時機選擇凍存,。

一,、類器官收集及洗滌

1、收集：移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5孔為一組）,。

2、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除）,，4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強,，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）,。

3,、接下來將離心管進行300g，4℃,，離心5min,，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時棄掉緩沖液,，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心,，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層）,，此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要,，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g）,，離心時間可適當(dāng)加長（最常不超過10min）。

二,、類器官凍存

1,、凍存密度，以24孔板為例

密度建議1：2孔/mL凍存液

密度建議2：500個類器官/mL凍存液（如果想計數(shù)凍存,，可以參照此密度建議）

2,、添加適量類器官凍存液F,，輕柔吹打重懸，建議立即進行凍存,。（放置太久,，DMSO對類器官有損傷）

3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜,，第二天取出放入液氮罐,。

     手動凍存：4℃冰箱放置30min，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1h,，然后移至-80℃過夜,，第二天取出放入液氮罐。

復(fù)蘇

一,、實驗前準(zhǔn)備

1,、將水浴鍋預(yù)熱至37℃；

2,、細胞實驗室進行常規(guī)消毒,，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；

3,、在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管,、吸管、培養(yǎng)板等,。

二,、取出凍存管

1、根據(jù)類器官凍存記錄按標(biāo)簽找到所需類器官的編號,。

2,、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管,，同時核對凍存管外的編號,。

三、迅速解凍

1,、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍,，并要不斷地?fù)u動，使管中地液體迅速融化,。

2,、約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁,，再拿入超凈臺內(nèi),。

四、將類器官凍存液移入15mL離心管,，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸,，輕柔吹打混勻,，300g 4℃離心5min，棄上清,。

五,、加膠-點板-加液

1、準(zhǔn)備工作

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化,；

（2）槍頭,、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時；

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存,，建議2周內(nèi)用完,。

2、復(fù)蘇要求

24孔板(abs7035),，每孔25uL基質(zhì)膠類器官混合物,，500-750uL類器官培養(yǎng)液

3、復(fù)蘇密度

復(fù)蘇密度建議1：1:1接種（原來凍幾孔就復(fù)蘇幾孔）

復(fù)蘇密度建議2：250個類器官/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

4,、加膠-點板

向類器官沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行,。操作熟練以后,，加膠，混勻,，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

5,、加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng)。大概10-14天,，多數(shù)類器官直徑在200um-500um,，可進行傳代操作。

6,、腦類器官鑒定圖

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