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流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometery)是利用流式細(xì)胞儀(flow cytometer)對(duì)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒等進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù),、快速的定性,、定量分析或分選的技術(shù),，具有檢測(cè)速度快,、測(cè)量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大,、分析信息全面,、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn),，可用于細(xì)胞大小,、細(xì)胞顆粒度、DNA及RNA含量,、蛋白質(zhì)含量,、細(xì)胞特異抗原、細(xì)胞活性,、胞內(nèi)PH值,、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞功能分析等的檢測(cè),。

通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析

abs50001 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

FITC Annexin V染色的流式細(xì)胞術(shù)分析。 Human PBMC用12uM喜樹堿處理4h,。將細(xì)胞與FITC Annexin V在含有碘化丙啶(PI)的緩沖液中孵育,，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。經(jīng)過2h的處理,，主要有三組細(xì)胞：活細(xì)胞（FITC Annexin V和PI陰性）和凋亡早期（FITC Annexin V陽(yáng)性和PI陰性）和FITC Annexin V和PI雙陽(yáng)性的細(xì)胞,。

流式細(xì)胞術(shù)的基本原理

深入了解流式細(xì)胞術(shù)的基本原理，必須了解流式細(xì)胞儀,，流式細(xì)胞儀的基本元件包括液路系統(tǒng),、光路系統(tǒng)以及電子系統(tǒng)三個(gè)部分。

液路系統(tǒng)：確保細(xì)胞單個(gè)排列通過,，每次分析一個(gè)細(xì)胞,；

光路系統(tǒng)：產(chǎn)生、收集,、分離和轉(zhuǎn)換光信號(hào),，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供基礎(chǔ),；

電子系統(tǒng)：處理和保存由光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)到的信號(hào)，并將這些信號(hào)轉(zhuǎn)換為可用于分析的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù),。

液路系統(tǒng)

液路系統(tǒng)的作用是將樣品排列成單列細(xì)胞/顆粒流,，并使細(xì)胞/顆粒穩(wěn)定高速的通過流式細(xì)胞儀的檢測(cè)點(diǎn)，主要包含流動(dòng)室+鞘液+廢液+上樣器+壓力控制系統(tǒng)

● 上樣速度越高,，樣本中心液流(sample core)越粗,，激光聚焦越差，分辨率越低,；

● 定性測(cè)量一般對(duì)流速要求不高,，例如免疫分型；

● 定量測(cè)量嚴(yán)格要求低速,，例如細(xì)胞周期檢測(cè),。

流式細(xì)胞中的光信號(hào)

1、散射光信號(hào)

散射光信號(hào)是細(xì)胞的固有參數(shù),，不需要使用熒光標(biāo)簽,；

● 前向散射光(forward scatter)：FSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)；

● 側(cè)向散射光(side scatter)：SSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān),；

● FSC-SSC的作用：利用細(xì)胞大小和顆粒度初步區(qū)分細(xì)胞群,、去除細(xì)胞碎片、去除黏連細(xì)胞,。

從細(xì)胞進(jìn)入激光照射區(qū)到離開,，產(chǎn)生一個(gè)電脈沖信號(hào)。H是脈沖高度,，代表脈沖信號(hào)的峰值,；W是脈沖寬度，是指細(xì)胞通過激光照射區(qū)域的時(shí)間,；A是脈沖信號(hào)的面積,。

實(shí)際操作中，部分細(xì)胞與細(xì)胞會(huì)粘在一起,，連續(xù)通過激光照射區(qū),，被儀器認(rèn)定為一次信號(hào)，對(duì)我們最終的數(shù)據(jù)分析造成干擾,。當(dāng)粘連體出現(xiàn)測(cè)量高度不變,，寬度和面積變?yōu)閮杀叮闯霈F(xiàn)FSC-Height不變,，F(xiàn)SC-Area和Width增大的現(xiàn)象,。

我們可以使用FSC-A與FSC-H來(lái)排除粘連體，正常單細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀激光照射區(qū)時(shí),，H和A是成正比增大的,，而粘連體通過時(shí),，H不變，A增大,，因此,，可通過細(xì)胞的FSC-A(Area)與FSC-H(Height)參數(shù)wan美排除掉粘連體，也可以通過FSC-H與FSC-W來(lái)操作,，但此種方法對(duì)于復(fù)雜樣本（樣本中各種細(xì)胞大小差異較大）不太適用,，實(shí)際上，去除粘連體的重要步驟在樣本制備階段,。

2,、熒光信號(hào)

在流式細(xì)胞術(shù)中，熒光信號(hào)的產(chǎn)生是由于特定的熒光素分子吸收一定波長(zhǎng)的光后躍遷到激發(fā)態(tài),，然后釋放光子（熒光）回到基態(tài),。了解熒光信號(hào)的產(chǎn)生以及各部分元件,，有助于我們多色配色,。

激光：提供單色光束，用于激發(fā)細(xì)胞中的熒光標(biāo)記物,，常見激光器有355nm（紫外）,、405nm（紫色）、488nm（藍(lán)色）,、561nm（黃綠色）,、633nm（紅色）。有的流式細(xì)胞儀只配備488nm,；有的流式細(xì)胞儀配備兩種激光器如488nm與638nm,。多色流式則可能需要更多的激光器。

濾光片：通常包括帶通濾光片,、長(zhǎng)通濾光片,、短通濾光片，帶通濾光片,。帶通濾光片允許一個(gè)固定范圍內(nèi)波長(zhǎng)的光通過,。如BP530/30表示允許波長(zhǎng)515nm-545nm范圍的光通過，長(zhǎng)通允許特定波長(zhǎng)以上的光通過,，特定波長(zhǎng)以下的光不能通過,。短通濾光片使特定波長(zhǎng)以下的光通過。

分光棱鏡：將激光器發(fā)出的光線和細(xì)胞散射或熒光發(fā)射出來(lái)的光線分開,，確保不同顏色的熒光可以被不同的檢測(cè)器準(zhǔn)確地捕捉到,。

熒光信號(hào)檢測(cè)器：檢測(cè)分光棱鏡分離出的熒光信號(hào)。每個(gè)檢測(cè)器對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的熒光波長(zhǎng),，用于測(cè)量細(xì)胞中特定熒光標(biāo)記物的強(qiáng)度,。

電子系統(tǒng)

主要負(fù)責(zé)處理和數(shù)字化由光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)到的光信號(hào)

放大：當(dāng)細(xì)胞或顆粒通過檢測(cè)點(diǎn)時(shí),，激光束照射到它們上產(chǎn)生的光信號(hào)（包括前向角散射(FSC)、側(cè)向散射(SSC)和熒光信號(hào)）被光電倍增管(PMT)或光電二極管(PD)探測(cè)到,，并轉(zhuǎn)化為電信號(hào),。這些初始的電信號(hào)通常很弱，需要通過信號(hào)放大器進(jìn)行放大,。

模數(shù)轉(zhuǎn)換(ADC)：放大后的電信號(hào)通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào),。ADC的位數(shù)（如14到24位）決定了信號(hào)的解析率和能轉(zhuǎn)化的數(shù)值范圍。

脈沖分箱(Pulse Processing)：每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)的電壓脈沖會(huì)被進(jìn)行分箱,，即按照一定的采樣率和ADC的解析率,，將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，并存儲(chǔ)為數(shù)據(jù)以備后續(xù)分析,。

數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與分析：數(shù)字信號(hào)被傳送到電腦,，存儲(chǔ)為數(shù)據(jù)文件，以備分析,。這些數(shù)據(jù)文件通常以標(biāo)準(zhǔn)的流式細(xì)胞儀文件格式輸出,，如FSC數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)文件。

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爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC,、IHC,、凋亡、ELISA,、ChIP,、Co-IP、TR-FRET,、生化檢測(cè),、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè)),；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒,；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒),；化合物大包裝；輔助試劑,、耗材/儀器,、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

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