細(xì)胞是生命的基本單位，是生物學(xué)研究中非常有用的工具,。細(xì)胞培養(yǎng)的過程就是人工模擬細(xì)胞體內(nèi)生長環(huán)境,，置于無菌、適宜溫度及酸堿度的環(huán)境中,，保證充足的營養(yǎng)使其不斷生長繁殖,，并維持其結(jié)構(gòu)和功能。作為基礎(chǔ)又常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技能,，自然頗受關(guān)注,。后續(xù)會創(chuàng)建《常見細(xì)胞培養(yǎng)攻略》系列，會為大家介紹一些常見細(xì)胞的培養(yǎng)方案,，包括但不限于T細(xì)胞,、B細(xì)胞、NK細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞,、干細(xì)胞培養(yǎng)等。今天主要是細(xì)胞培養(yǎng)入門指南的相關(guān)內(nèi)容,，其他的內(nèi)容大家可以持續(xù)關(guān)注追更,。
1. 細(xì)胞類型
1) 原代細(xì)胞(primary cell)：是指從機(jī)體的組織經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個細(xì)胞并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞,。一般認(rèn)為,，培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。
2) 細(xì)胞系(cell line)：原代細(xì)胞經(jīng)初次傳代成功后即為細(xì)胞系,，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成,。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系,，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系,。
3) 細(xì)胞株(cell strain)：是通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在,。
圖1 動物細(xì)胞培養(yǎng)的步驟(General Procedure for Cell Culture)
2. 培養(yǎng)體系
1) 培養(yǎng)體系的選擇：主要分為含血清的經(jīng)典培養(yǎng)體系和無血清培養(yǎng)體系,。簡單、細(xì)胞種類,、小規(guī)模選擇含血清培養(yǎng)體系,；長周期、強(qiáng)掌控,、追求細(xì)胞質(zhì)量可選擇無血清培養(yǎng)體系,。
表1 含血清和無血清培養(yǎng)體系的區(qū)別圖（圖片源于優(yōu)寧維）
2) 血清的選擇：分為胎牛血清、新生牛血清、小牛血清,；其中胎牛血清的普適性較好,。血清主要為細(xì)胞提供基本的營養(yǎng)；血清中的微量元素可參與細(xì)胞的解毒代謝,；血清中的抗蛋白酶成分也可以起到中和保護(hù)細(xì)胞的作用,。小伙伴們想要了解更多血清信息，可以查看《細(xì)胞培養(yǎng)常見問題之血清篇》,。當(dāng)然,，具體細(xì)胞使用何種血清可以參考相關(guān)文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)驗(yàn)。
表2 不同血清的區(qū)別圖（圖片源于優(yōu)寧維）
3) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇：根據(jù)培養(yǎng)基的來源和組成成分,，分為天然培養(yǎng)基（組織提取液）,、合成培養(yǎng)基（經(jīng)典液體培養(yǎng)基如1640、DMEM等）,、無血清培養(yǎng)基（如Lonza的X-VIXO系列培養(yǎng)基）,。目前合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基使用居多。同樣,，具體細(xì)胞使用何種培養(yǎng)基也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)驗(yàn),。
4) 抗生素：目前實(shí)驗(yàn)室會在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加雙抗（青霉素-鏈霉素）或者三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）用來預(yù)防細(xì)胞污染，但是對于長期的細(xì)胞培養(yǎng)并不建議持續(xù)使用抗生素,，以防細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性,。
5) 培養(yǎng)基中酚紅的選擇：作為PH指示劑，酚紅是培養(yǎng)基的“?？?,。酚紅為雌激素類似物，在進(jìn)行激素誘導(dǎo)或培養(yǎng)雌激素敏感的細(xì)胞時(shí)應(yīng)慎用,，另外酚紅可能對下游的流式檢測分析帶來一定的干擾,。
文中部分相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
胎牛血清（優(yōu)級） | abs972-500ml |
RPMI 1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺，不含HEPES,，不含酚紅） | abs9275 |
青霉素-鏈霉素溶液（100×,，雙抗） | abs9244 |
3. 細(xì)胞來源
1) 從有資質(zhì)的公司直接進(jìn)行購買：比如Absin可提供全面的原代細(xì)胞及優(yōu)化后適配的培養(yǎng)基，試劑和方案,；ATCC作為全球quan威的生物資源中心之一,，提供原代細(xì)胞、細(xì)胞系,、微生物,、重組物質(zhì)等。
2) 從生物體中提取制備：如血液樣本,、實(shí)體組織樣本等,。
3) 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的凍存細(xì)胞復(fù)蘇獲得：細(xì)胞復(fù)蘇的步驟在基本操作里面,，大家可以接著往下讀。
文中部分相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
膠原酶I型 | abs47048000 |
膠原酶II型 | abs47048001 |
4. 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)信息收集及物質(zhì)
所謂信息收集是指我們要在開始細(xì)胞培養(yǎng)前充分全面了解我們的細(xì)胞,，大家可以參考文獻(xiàn),、ATCC的或者是實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，需要獲得的信息包括不限于以下幾個方面：
1) 細(xì)胞特性：細(xì)胞的形態(tài),、增殖速度,、細(xì)胞周期、傳代頻率……
2) 生長方式：貼壁or懸浮
3) 培養(yǎng)體系：含血清or無血清
4) 溫度：多數(shù)人和哺乳動物細(xì)胞系是36-37℃,；昆蟲細(xì)胞27℃
5) PH：多數(shù)哺乳動物細(xì)胞系是7.4,，昆蟲細(xì)胞系6.2
6) CO2：多數(shù)適合5-7%CO2
5. 細(xì)胞培養(yǎng)基本原則
1) 無菌意識：使用無菌設(shè)備、試劑和耗材,；使用個人防護(hù)裝備,，避免污染；試劑如有需要可使用0.22μm的過濾器進(jìn)行無菌過濾,；每次操作只處理一株細(xì)胞株,，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,，超凈臺以紫外燈照射 30 分鐘滅菌,，以 70 % 乙醇擦拭無菌操作臺面；實(shí)驗(yàn)完畢后,，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺,，以 70 % 乙醇 擦拭無菌操作臺面。
2) 試劑分裝：培養(yǎng)基,、血清,、胰酶等試劑要養(yǎng)成分裝保存的習(xí)慣，不同的細(xì)胞即使適配的培養(yǎng)基配方相同也要另外配制分裝并做好標(biāo)記,。
3) 及時(shí)保種：尤其是珍貴細(xì)胞,，在細(xì)胞狀態(tài)良好的時(shí)候要及時(shí)凍存保種，以備不時(shí)之需,。
6. 基本操作
1) 顯微鏡觀察：首先觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色（如果培養(yǎng)基中含有酚紅指示劑的話,，當(dāng)培養(yǎng)液顏色變?yōu)辄S色就意味著營養(yǎng)物質(zhì)耗盡），其次鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài),。如果細(xì)胞的長勢良好,，且匯合度未達(dá)到傳代的要求，可視培養(yǎng)液顏色決定時(shí)候換液,；若細(xì)胞生長狀態(tài)不好，匯合度低,，需要酌情優(yōu)化培養(yǎng)條件,，排除污染情況,；若細(xì)胞過于密集，則需進(jìn)行傳代操作,。
細(xì)胞匯合是指細(xì)胞在培養(yǎng)皿中附著生長的過程,。匯合度是指細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿的百分比，不同類型的細(xì)胞需要達(dá)到不同匯合度后才能進(jìn)行傳代,。
圖2 顯微鏡觀察細(xì)胞流程（圖片源于優(yōu)寧維）
2) 細(xì)胞復(fù)蘇
圖3 PBMC細(xì)胞復(fù)蘇流程圖
（PBMC Thawing Protocol: How to Optimize Cell Recovery）
a) 37℃水浴加熱需要使用的培養(yǎng)基,；
b) 從液氮中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡量減少其暴露在室溫（15-25℃）的時(shí)間,；
c) 在37℃水浴快速解凍細(xì)胞,，將凍存管轉(zhuǎn)移到生物安全柜中，用70%乙醇或異丙醇擦拭凍存管外部,；
d) 將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中,，加入1mL培養(yǎng)基潤洗凍存管，培養(yǎng)基同樣收集到50mL離心管中,；
e) 向50mL離心管中補(bǔ)加15-20mL培養(yǎng)基,，室溫300xg離心10分鐘；
f) 小心棄掉離心后的上清液,，使用適量wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，分裝到合適的培養(yǎng)皿/瓶中，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和狀態(tài),，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
3) 細(xì)胞傳代
圖4 細(xì)胞傳代流程圖
（Cell Plating, Media Change, and Culture Maintenance Protocol）
a) 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、匯合度以及是否污染,，判斷是否進(jìn)行傳代處理,；
b) 以25cm2培養(yǎng)瓶、貼壁細(xì)胞為例,，棄掉培養(yǎng)基,，使用無菌PBS洗滌細(xì)胞以去除抑制胰蛋白酶功能的血清；
c) 加入2ml胰酶,，覆蓋細(xì)胞層,，放入37℃ CO2培培養(yǎng)箱中孵育2min，期間可拿出觀察細(xì)胞消化脫落情況（注意：不同細(xì)胞使用的胰酶濃度及消化時(shí)間不同）,；
d) 棄掉胰酶,，加入2ml wan全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞；
e) 顯微鏡下計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞密度分裝到培養(yǎng)瓶中,，將細(xì)胞置于 37oC, 5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4) 細(xì)胞凍存
圖5 分步凍存法流程圖
a) 在細(xì)胞密度達(dá)到107 cells/mL時(shí)可進(jìn)行凍存,，采用分步冷凍法,；
b) 懸浮細(xì)胞500 g室溫離心10 min收集細(xì)胞沉淀,，貼壁細(xì)胞胰酶消化并終止后離心收集；
c) 棄上清,，凍存液重懸細(xì)胞沉淀,，1mL分裝并做好標(biāo)記；
d) 將凍存管放置-20℃ 1h,；-80℃過夜,；轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長期保存。
文中部分相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（50mL,，透氣蓋） | abs7011-1箱 |
胰蛋白酶消化液（0.25%,，含酚紅） | abs47014937-100ml |
細(xì)胞凍存液（含血清） | abs9473-100mL |
無血清細(xì)胞凍存液（科研級） | abs9417-100mL |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC,、凋亡,、ELISA、ChIP,、Co-IP,、TR-FRET、生化檢測,、殘留檢測,、多因子檢測)；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子),、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒),；化合物大包裝,；輔助試劑、耗材/儀器,、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE,、B27、N2,、霍亂毒素B亞單位CTB,、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX,、重組人胰島素Insulin,、人源低密度脂蛋白LDL...
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
9
立即詢價(jià)
您提交后,，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)