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大家好,！今天我們來聊聊免疫組化(IHC)實驗的操作流程。IHC是一個超級強大的技術(shù),，能夠讓你在組織切片中找到特定的蛋白質(zhì),。跟我來，我們一步步搞定它,，讓實驗變得輕松愉快,！

IHC實驗流程：通常包括樣本固定、包埋,、切片,、脫蠟水化、抗原修復(fù),、滅活,、封閉、一抗孵育,、二抗孵育,、顯色、復(fù)染,、封片觀察12個部分,。

1、樣本固定

目的：確保組織樣本的質(zhì)量和完整性,，為后續(xù)的免疫染色打下堅實基礎(chǔ),。

操作步驟：

1）取材：從動物或人體取得所需的組織樣本。對于組織塊,，要確保其大小適中,，不宜過大，以便于固定液能夠充分滲透,；

2）初步處理：如果組織樣本帶有血液或其他體液,，應(yīng)先用生理鹽水或PBS進行沖洗，以去除這些可能影響固定效果的物質(zhì),；

3）固定：將組織樣本放入固定液中,。常用的固定液有4%多聚甲醛溶液(abs9179),，冰凍切片/神經(jīng)組織可以使用OCT包埋劑(abs9756)固定液的量通常為組織體積的10-20倍，以確保組織能夠充分浸入固定液中,。大組織標本應(yīng)切開固定,，以免中間部分自溶解腐敗。

 注：固定時間根據(jù)組織類型和實驗要求而定,，一般固定時間室溫18-24h,。

4）固定后的處理：固定完成后，將組織從固定液中取出,，用流水沖洗數(shù)分鐘,，以去除殘留的固定液和可能產(chǎn)生的結(jié)晶。

注意事項：

固定的時間不宜過長,，以免導(dǎo)致組織過度硬化和抗原性的喪失,；

固定的溫度通常為室溫或 4°C，避免高溫導(dǎo)致組織損傷,；

在固定過程中,，要確保組織樣本wan全浸入固定液中，避免出現(xiàn)未固定的部分,；

固定的容器應(yīng)干凈,、無雜質(zhì)，避免對組織造成污染,。

2,、包埋

目的：保護和支撐組織樣本，以便在切片時保持其完整性,。通過將組織樣本嵌入到固體介質(zhì)中，可以制作出適合在顯微鏡下觀察的薄切片,。

根據(jù)樣本類型可以分為石蠟切片免疫組化(IHC-P)和冰凍切片免疫組化(IHC-F),，石蠟切片免疫組化雖然操作更加復(fù)雜，但其可以更好的保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),，厚度更薄便于染色和觀察,，以及可以常溫保存多年的優(yōu)點，在實驗中更為常用,。

基本步驟：

1）脫水：在組織樣本固定后,，需要將其中的水分去除，以便于包埋介質(zhì)能夠充分滲透,。酒精梯度脫水：75%乙醇(1h)——85%乙醇(1h)——95%乙醇(1h)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)

2）透明：脫水后,，組織樣本會變得不透明，需要使用透明劑（如二甲苯）來去除其中的酒精和其他溶劑,，使組織樣本變得透明,。通常用二甲苯浸泡：二甲苯(40min)——二甲苯(40min)——二甲苯(40min)

3）浸蠟：將透明后的組織樣本放入熔化的石蠟中,，讓石蠟充分滲透到組織樣本中。這個過程通常需要在溫箱中進行,，以確保石蠟的均勻滲透：63℃石蠟(50min)——63℃石蠟(50min)——63℃石蠟(50min)

4）包埋：將浸蠟后的組織樣本放入模具中,，倒入熔化的石蠟，然后讓石蠟冷卻凝固,。這樣,，組織樣本就被包埋在石蠟中了。

注意事項：

在包埋過程中,，要控制好溫度和時間,，以確保石蠟的均勻滲透和組織的完整性。

包埋后的組織塊需要冷卻凝固后才能進行切片,。在冷卻過程中,，要避免過度冷卻導(dǎo)致石蠟碎裂或組織變形。

在包埋前,，要對組織樣本進行充分的固定和脫水處理,，以確保其抗原性和完整性。

3,、切片

目的：將包埋后的組織樣本切割成薄片,，以便于在顯微鏡下觀察和檢測。

基本步驟：

1）切片前的準備：確保包埋后的組織塊已經(jīng)充分冷卻并固化,。使用適當?shù)那衅瑱C進行切片,；

2）切片：將包埋好的組織塊固定在切片機的樣本夾上。調(diào)整切片機的切片厚度,，通常為4-5微米厚,，這個厚度是根據(jù)需要檢測的抗原和實驗要求來確定的；

3）展片：使用刷子或毛筆輕輕地將切好的組織切片從刀上取下,，并放在溫水(40℃)中展開,；

4）烤片：60℃烤片2h。

注意事項：

在切片過程中,，要控制好切片機的速度和切片刀的鋒利度,，以獲得高質(zhì)量的切片。

切片后,，要及時對切片進行處理,，以避免抗原的損失和組織的變性。

使用適當?shù)酿べN劑,，確保切片牢固地附貼在載玻片上,，以便于后續(xù)的免疫組化實驗。

4,、脫蠟水化

目的：將組織切片從石蠟中釋放出來,，并使其恢復(fù)到適合進行后續(xù)抗原檢測和染色的狀態(tài),。

基本步驟：

1）脫蠟：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蠟,。將切片放置于切片架內(nèi)：二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——二甲苯(5min)

2）水化：100%乙醇(5min)——100%乙醇(5min)——95%乙醇(3min)——85%乙醇(3min)——75%乙醇(3min)——去離子水(5min)

注意事項：

徹di脫蠟：脫蠟過程必須徹di,，以確保石蠟被wan全去除。否則,，殘留的石蠟會影響后續(xù)的抗原檢測和染色,。

避免干燥：在整個脫蠟水化過程中，應(yīng)確保切片始終保持在濕潤的狀態(tài),，避免干燥,。干燥會導(dǎo)致非特異性抗體結(jié)合，從而出現(xiàn)高背景染色,。

5,、抗原修復(fù)

目的：通過修復(fù)過程暴露被固定時隱藏的抗原表位，提高抗體的結(jié)合效率,。zui常用的修復(fù)緩沖液是10mM的pH6.0檸檬酸鈉(abs9248),、pH9.0的Tris-EDTA(abs9342)、pH8.0的EDTA,。建議測試多種方法以尋找染色效果好的方法,。

抗原修復(fù)的方法：

1）微波熱修復(fù)：加入抗原修復(fù)液，放入切片,，置于微波爐中火8min,，停火7min,，轉(zhuǎn)小火8min,；取出染色盒，冷卻至室溫,；

2）水浴熱修復(fù)：加入抗原修復(fù)液,，放入切片，置于水溶鍋中加熱,，其間不斷用溫度計測其溫度,，待抗原修復(fù)液的溫度達到有效度(92℃),，維持40min后取出染色盒,，冷卻至室溫；

3）高壓熱修復(fù)：在染色盒中加入抗原修復(fù)液,，放入切片,，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓后繼續(xù)加熱5min，關(guān)閉電源,，10min后取出染色盒,，冷卻至室溫,；

4）酶解修復(fù)：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶,、蛋白酶K等,。將切片置于含有酶解液的載玻片上，然后在適當?shù)臏囟群蜐穸葪l件下進行酶解（通常為37°C,，20min）,。酶解后，同樣需要冷卻切片至室溫再進行后續(xù)處理,。

注意事項：

加熱后需自然降溫,；

使用過量的抗原修復(fù)液；

修復(fù)液的不同pH值對染色結(jié)果的影響比較大,；

沒有一種抗原修復(fù)緩沖液可以適用于所有抗原,。不同的抗體可能需要不同的抗原修復(fù)方法和條件，因此需要根據(jù)實驗要求和抗體特性選擇合適的抗原修復(fù)方法,。

6,、滅活

目的：消除細胞或組織中內(nèi)源性酶和活性物質(zhì)的影響，降低背景噪音,，提高實驗的特異性和敏感性,。

1）滅活內(nèi)源性過氧化物酶：HRP檢測系統(tǒng)，常用的去除內(nèi)源性過氧化物酶的方法是3%過氧化氫水溶液,，室溫10min,；

2）洗滌：用PBS或TBS等緩沖液洗滌切片、浸泡2次,，5min/次,。

 注意事項：

H₂O₂需現(xiàn)用現(xiàn)配，且4℃避光保存,，否則易引起非特異背景,；

H₂O₂孵育時間過長也會易引起脫片；

部分組織還含有內(nèi)源性堿性磷酸酶,，可用左旋咪唑進行滅活,。

7、封閉

目的：封閉組織切片上非特異性結(jié)合位點,，防止抗體與這些位點結(jié)合,，從而減少背景信號。

基本步驟：

1）非特異位點封閉：將封閉液 （如abs933山羊血清）滴加到組織切片上,，確保封閉液均勻覆蓋整個組織區(qū)域,。然后將切片放入濕盒中，在室溫或37°C下孵育30min,，讓封閉液與組織切片充分作用,。

2）洗滌：封閉結(jié)束后,，用PBS或TBS等緩沖液洗滌切片，以去除未結(jié)合的封閉液和可能存在的雜質(zhì),。

8,、一抗孵育

免疫組化中的一抗孵育是免疫組化實驗的關(guān)鍵步驟之一。

目的：特異性識別目標抗原,，為后續(xù)的檢測提供準確標記,。

基本步驟：

1）選擇一抗：根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇特異性高、親和力強的一抗,。一抗應(yīng)該與目標抗原的種屬來源,、類型等相匹配；

2）稀釋一抗：根據(jù)一抗的效價和實驗要求,，用適當?shù)南♂屢喝鏟BS,、TBS等（或abs9299抗體稀釋液）稀釋一抗；

3）涂覆一抗：將稀釋好的一抗均勻涂覆在已封閉的組織切片上,，確?？贵w能夠充分接觸組織切片上的抗原；

4）孵育：將稀釋好的一抗均勻滴加在已封閉的組織切片上,，放入濕盒中,，室溫 (或37°C) 孵育1h，使一抗與抗原充分結(jié)合,。

注意事項：

確保一抗的質(zhì)量和特異性,，避免使用過期或質(zhì)量不佳的一抗；

充分洗滌組織切片,，去除未結(jié)合的一抗和其他雜質(zhì),，減少背景染色。

9,、二抗孵育

目的：二抗的作用是與一抗結(jié)合,，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，從而增強信號的強度和特異性,。

在免疫組化實驗中,，二抗通常帶有標記酶 (如HRP.AP等)，這些標記物在后續(xù)的顯色步驟中可以產(chǎn)生可見的染色信號,，便于在顯微鏡下觀察目標抗原在組織中的分布和表達情況,。

二抗孵育的基本步驟：

1) 稀釋二抗：參考二抗的說明書,，按照適當比例用封閉液或其他適當?shù)娜芤合♂尪梗?/span>

2) 孵育二抗：將稀釋好的二抗滴加在已經(jīng)過一抗孵育并洗滌的組織切片上,，室溫孵育30min-60min,。

3) 洗滌：孵育完成后,，使用洗滌液（如PBST或TBST）在搖床上緩慢搖動洗滌切片,，以去除未結(jié)合的二抗和其他雜質(zhì),。洗滌通常需要重復(fù)幾次，每次洗滌時間一般為5-10min,。

10,、顯色反應(yīng)

目的：顯色檢測中需要考慮的其他因素有酶和顯色底物的選擇。每種檢測酶都有幾種不同的顯色劑,，HRP-DAB是zui常用的顯色劑組合,。

原理：在免疫組化中通常使用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)等作為標記酶。這些酶能催化底物發(fā)生顏色反應(yīng),，從而在抗原所在的位置形成可見的沉淀物,。

基本步驟：

1）加入酶的底物（如HRP的底物為DAB，AP的底物為BCIP/NBT）,。

2）底物在酶的作用下發(fā)生化學(xué)反應(yīng),，形成有色沉淀物，通常呈現(xiàn)棕色（對于HRP-DAB系統(tǒng)）或藍色（對于AP-BCIP/NBT系統(tǒng)）,。

3）密切觀察切片顯色程度和顯色時間,，一般為3-8min，及時用蒸餾水洗脫,，防止顯色過深,。通過顯微鏡觀察組織切片上的顏色變化，可以確定抗原在細胞或組織中的位置和表達水平,。

注意事項：

DAB工作液現(xiàn)用現(xiàn)配

選擇適當?shù)臋z測系統(tǒng)：根據(jù)實驗?zāi)康暮蜆颖咎匦赃x擇合適的檢測系統(tǒng),；

優(yōu)化條件：對一抗、二抗的濃度,、孵育時間和溫度等條件進行優(yōu)化,，以獲得最佳的檢測結(jié)果；

注意防護：DAB為聯(lián)苯偶氨化合物,，可誘發(fā)皮膚癌和膀胱癥,，在顯色操作過程中需注意防護。

11,、復(fù)染

目的：為了形成細胞輪廓,，更好的定位目標蛋白，可進行復(fù)染,。

復(fù)染：滴加80-100μL蘇木素染色液至wan全覆蓋組織,，室溫孵育5min，1%鹽酸酒精分化1s,，自來水稍洗,，自來水返藍5min。

注意事項：

復(fù)染的時間是需要摸索的，這個與蘇木精的配制時間有關(guān),；

如果染色過淺可重復(fù)染色,，如果染色過深可使用鹽酸進行分化。

12,、封片觀察

目的：在免疫組化實驗中,，封片觀察是最后的步驟，用于保護組織切片,、增強對比度和穩(wěn)定性,，并允許在顯微鏡下進行長期觀察和分析。

封片步驟：

1）脫水：在完成所有染色步驟后,，通常需要將組織切片進行脫水處理,，以去除切片上的水分。切片依次使用70%,、85%,、95%乙醇、無水乙醇I,、無水乙醇Ⅱ分別浸泡1min,。

2）透明：脫水后，切片需要進行透明處理,，以便封片劑能夠均勻分布在切片上,。通常使用二甲苯浸泡兩次，每次1min,。

3）封片：將一滴封片劑（如中性樹膠abs9177）滴在組織切片上,，然后用蓋玻片輕輕覆蓋。封片劑的選擇取決于實驗要求和標本類型,。封片時要確保沒有氣泡產(chǎn)生,，并且蓋玻片與切片之間緊密貼合。

4）干燥：讓封片劑自然干燥,，或者可以在溫箱中加速干燥過程,。干燥后的切片可以長期保存，并隨時用于觀察,。

希望這份IHC實驗操作流程指南能幫助您在實驗中取得令人滿意的結(jié)果,！如果有任何問題或需要進一步的幫助，請隨時聯(lián)系愛必信生物,，我們隨時為您提供支持,。

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