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概述

類器官免疫共培養(yǎng)是一種先進的研究手段,，它結合了3D的類器官培養(yǎng)技術和免疫細胞，以模擬體內微環(huán)境并研究細胞間的相互作用,。這種共培養(yǎng)策略已被廣泛應用于疾病建模,、藥物篩選,、個性化治療、炎癥機制研究,、腫瘤免疫相互作用研究以及上皮-免疫細胞相互作用的研究。那么,，如何評估類器官免疫共培養(yǎng)殺傷效果,？小愛從免疫共培養(yǎng)方法和殺傷效果檢測方法兩方面給大家介紹一下,。

免疫共培養(yǎng)方法

一、PBMC制備

1,、實驗前準備

試劑提前1h準備：人淋巴細胞分離液(abs930)提前1h取出，在室溫充分平衡并顛倒混勻,。

2、外周血梯度密度離心步驟

（1）采集人的外周血樣本于抗凝管中，室溫保存，血液樣品離體建議2h內處理效果更好,，若無法及時處理,，4°C保存,，12h內處理；

（2）取15mL離心管，加入2mL血液，再加入2-4倍PBS(abs962)稀釋外周血,，吹打混勻,；

▲注意：血液樣本越稀釋,，單核細胞的純度越好,。

（3）取新的15mL離心管中,，加入5mL淋巴細胞分離液,，將試管稍微傾斜將4mL稀釋的外周血懸液沿著管壁緩慢的加入離心管,；

▲注意：人淋巴細胞分離液在使用前需室溫充分平衡并顛倒混勻，分離時溫度以18-25℃為宜,，不要破壞淋巴細胞分離液和細胞懸液的分界面。

（4）20℃,，400g離心30min。

▲注意：離心結束速度要設置升速(ACC)1,，降速(DEC)1,，不能驟停。

（5）離心后取出試管,，可以看到不同的分層（如下圖1）,，去除上層血漿層，小心地吸取白膜層(PBMC)到新的離心管中,；

（6）加入3倍體積的PBS,，和白膜層充分混勻,，18-20℃下以350g離心10-15min。小心棄去上清液,；

（7）重復步驟6-次,，進行后續(xù)共培養(yǎng)。

圖1 離心后血液分層

二,、類器官的收集

1,、類器官收集及洗滌

（1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質膠,，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）,；

圖2 分離類器官

（2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多,，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除）,，4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化,，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時,，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）；

（3）接下來將離心管進行300g,，4℃,，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖）,，此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可,。

圖3 分層現象

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關,。此時棄掉緩沖液,，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟,，再次冷化離心,，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層,、類器官沉淀層）,，此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠類器官混懸液層）,，此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠類器官混懸液,，保留下2/3即可。

圖4 分層現象

促進基質膠和類器官有效分離條件：

a. 離心機的選擇非常重要,，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離,；

b. 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g）,，離心時間可適當加長（最常不超過10min）,。

三、共培養(yǎng)

1,、試劑準備

T細胞無血清wan全培養(yǎng)基：免疫細胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)+200-500U/mL IL-2(abs04045)+3ug/mL CD3/CD28磁珠(abs160019),；

類器官無血清培養(yǎng)基：提前放于4℃融化；

96孔超低吸附培養(yǎng)板(abs7059)

▲注意：使用無血清體系和超低吸附板均可有效避免類器官貼壁,。

2,、共培養(yǎng)步驟

（1）使用T細胞無血清wan全培養(yǎng)基重懸PBMC，96孔板,，5*10^5個PBMC/每孔,，100uL細胞懸液/每孔；

（2）使用類器官無血清培養(yǎng)基重懸類器官,，向含T細胞的96孔板中加入250-333個類器官/每孔,，100uL類器官懸液/每孔，總體積200uL,，進行共培養(yǎng),。（24孔板，3-4萬T細胞,，類器官20個,；96孔板，0.5-1萬T細胞,，類器官5-6個）

殺傷檢測方法

檢測T細胞對腫瘤類器官殺傷效果有多種檢測指標,，比如T細胞靶向識別殺傷、免疫浸潤檢測,、類器官毒性LDH檢測,、上清細胞因子檢測、類器官活死染色,。接下來,，小愛給大家詳細聊一下每種檢測指標。

一,、T細胞靶向識別殺傷

使用CD31抗體偶聯FITC來標記T細胞，可以幫助研究者追蹤和分析T細胞的行為,，例如它們的遷移,、分布和與類器官的相互作用,。在上述免疫共培養(yǎng)方法的一、PBMC制備后,，進行T細胞標記,。

1、細胞計數和調整濃度：

計數T細胞,，并根據實驗需要調整細胞濃度,，通常在實驗前將細胞濃度調整到適當的工作濃度。

2,、抗體與細胞的孵育：

將FITC標記的CD31抗體(abs1840383)按照說明書推薦的濃度與T細胞懸液混合,，并在適當條件下孵育一段時間，使抗體與T細胞表面的CD31抗原充分結合,。

3,、洗滌：

孵育后，使用適當的緩沖液（如PBS）洗滌T細胞,，以去除未結合的抗體,。

4、然后緊接著做免疫共培養(yǎng)方法的二,、類器官的收集和三,、共培養(yǎng)；

5,、使用高內涵錄像及拍照,，可以實時檢測T細胞對類器官的識別及趨向運動，如下圖片及視頻： 

圖5 殺傷效果明腸圖

此圖為我司做得免疫共培養(yǎng)實驗,，從上圖可明顯看出B藥物作用下,，T細胞有明顯的殺傷效果。

視頻1 單獨類器官對照

視頻2 單獨T細胞對照

視頻3 T細胞和類器官共培養(yǎng)

圖解：相比于視頻1和視頻2,，對T細胞進行CD31抗體偶聯FITC標記后,，會看到T細胞不斷趨向類器官，并在類器官周圍聚集,，靶向識別殺傷類器官,，最終類器官出現發(fā)黑、崩解,、壞死,。

二、免疫浸潤檢測

1,、將共培養(yǎng)后的類器官和懸浮的T細胞分離：小心用槍頭將上清吸棄,，留下類器官；加入適量類器官傳代緩沖液(abs9730),，吹打重懸類器官,，待自然沉降后,，吸棄掉上清，可以根據實際情況選擇清洗次數,；

2,、類器官的石蠟切片免疫組化，可以參考鏈接類器官HE染色,、免疫組化,、免疫熒光鑒定方法，T細胞檢測marker根據實驗需求來,，比如CD31,。

三、類器官毒性LDH檢測

1,、實驗準備

（1）Lactate Dehydrogenase Microplate Assay Kit (abs580007)

注意：

底物：使用前加入1mL蒸餾水溶解,，-20℃保存；

染料試劑A：使用前加入9mL蒸餾水溶解,，混合,，4℃保存；

標準：使用前加1mL蒸餾水溶解,；然后加入0.3mL到0.7mL,；

蒸餾水：濃度為600μmol/L；

陽性對照：使用前加入0.1mL蒸餾水溶解,。

（2）酶標板讀取器讀取吸光度在450nm

（3）蒸餾水

（4）移液器,，多通道移液器

（5）冰

（6）離心機

（7）計時器

2、樣本準備

將共培養(yǎng)后的上清液轉移到試劑盒自帶的96孔微孔板,。

3,、實驗步驟

在微孔板中加入以下試劑：

注意：

（1）將上面的標準品連續(xù)稀釋2倍，制作標準曲線,；

（2）對于未知的樣品,，我們建議做一個預實驗和測試幾個劑量確保讀數在標準曲線范圍內。如果酶活性較低,，請在反應體系中加入更多的樣品,，或者增加反應時間；如果酶活性較高,，請稀釋樣品,，或減少反應時間。

4、計算

單位定義：一個單位的LDH活性被定義為酶每分鐘產生1nmol NADH,。

根據上清體積

LDH (U/mL) = (C_Standard × V_Standard) × (OD_Sample - OD_Control) / (OD_Standard - OD_Blank)/V_Sample/T

= 1200 × (OD_Sample - OD_Control) / (OD_Standard - OD_Blank)

C_Standard：標準品濃度,，600μmol/L = 600 nmol/mL；

V_Sample：樣品體積,，0.01mL；

V_Standard：標準品體積,，0.1mL,；

T: 反應時間，5minutes

5,、典型數據

標準曲線僅供演示,。每次測定必須重新測定標準曲線。

圖6 標準曲線

檢測范圍：30μmol/L-600μmol/L

圖7 96孔板陽性對照反應柱狀圖

四,、上清細胞因子檢測

類器官免疫共培養(yǎng)用于評估細胞殺傷效果時,，可以通過檢測上清液中的細胞因子來反映免疫細胞的活性和對類器官的影響。以下是一些常見的細胞因子,，它們在評估免疫細胞殺傷效果時可能被檢測：

干擾素-γ(IFN-γ)：通常由活化的T細胞和NK細胞產生,，與細胞毒性和免疫調節(jié)有關；

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)：由多種免疫細胞產生,，參與細胞死亡和炎癥反應,；

白細胞介素-2(IL-2)：主要由活化的T細胞產生，促進T細胞增殖和活化,；

白細胞介素-4(IL-4)：主要由Th2細胞產生,，參與體液免疫反應和抗炎作用；

白細胞介素-6(IL-6)：一種多功能細胞因子,，參與免疫應答和炎癥反應,；

白細胞介素-10(IL-10)：具有抗炎作用，由多種細胞類型產生,，包括調節(jié)性T細胞,；

白細胞介素-12(IL-12)：促進Th1細胞分化和IFN-γ的產生；

白細胞介素-17(IL-17)：主要由Th17細胞產生,，與炎癥和自身免疫疾病有關,；

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)：促進粒細胞和巨噬細胞的增殖和活化；

粒細胞集落刺激因子(G-CSF)：促進中性粒細胞的增殖和活化,；

趨化因子：如CXCL8(IL-8),、CCL2(MCP-1)等，參與免疫細胞的遷移和定位,；

穿孔素(Perforin)：由細胞毒性T細胞和NK細胞釋放,，用于殺死靶細胞；

顆粒酶(Granzymes)：與穿孔素一起由細胞毒性T細胞和NK細胞釋放，引起細胞凋亡,；

調節(jié)性T細胞相關細胞因子：如TGF-β,，由調節(jié)性T細胞產生，具有免疫抑制作用,；

生長因子：如血管內皮生長因子(VEGF),，可能與腫瘤血管生成和免疫逃逸有關。

檢測這些細胞因子可以通過多種方法進行,，包括但不限于酶聯免疫吸附測定(ELISA),、多因子檢測試劑盒、細胞因子芯片,、流式細胞術等,。選擇哪種檢測方法取決于實驗設計、所需靈敏度和特異性,、以及實驗預算,。通過分析這些細胞因子的水平，可以評估免疫細胞對類器官的殺傷效果和免疫反應的總體情況,。

以最常測的IFN-γ為例,，采用ELISA方法舉例：

1、實驗準備

（1）Human IFN-γ ELISA Kit(abs510007-96T)

（2）酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）

（3）高精度加液器及一次性吸頭

（4）蒸餾水或去離子水

（5）洗瓶（噴瓶）,、多通道洗板器或自動洗板機

（6）500mL量筒

2,、樣品準備

培養(yǎng)上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本,。樣本收集后若不及時檢測,，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內,，避免反復凍融,。樣本可能需要用稀釋劑(1×)稀釋。

3,、試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫,，靜置15min,。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）

①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液,。取10mL濃縮洗,。例：滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量,，再進行配制,。

②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液,。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL,。實際操作時可先依據樣本稀釋倍數，計算所需的稀釋用緩沖液用量,，再進行配制。

③檢測抗體：將干粉離心至管底,，使用110uL稀釋用緩沖液(1×)溶解,，室溫靜置5min后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液,。按照每孔用量100uL計算所需體積,。 使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體,。例：使用稀釋用緩沖液(1×)定容至1mL,，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。

④SA-HRP：SA-HRP為40×母液,，使用前需使用稀釋緩沖液(1×)稀釋配制成1×工作液,，每孔所需量為100uL。例： 使用了10個孔,，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液(1×)定容至1mL,，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。

⑤顯色劑：按每孔100uL,，計算當次試驗所需要用量,，取出相應體積的顯色劑，避光,；取出的顯色劑僅供當日使用,。

⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液(1×)重溶，重溶體積1000uL,，得到濃度為600pg/mL標準品母液,。輕輕震搖至少5min，其充分溶解,。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液(1×),。將標準品母液參照下圖做系列稀釋,，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點(600pg/mL),，稀釋用緩沖液(1×)可用作標準曲線零點(0pg/mL),。

圖8 標準品稀釋比例示意圖

二、操作步驟

1,、準備好所有需要的試劑和標準品,；

2、從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板,，未用的板條請放回鋁箔袋內,，重新封口；

3,、向微孔板中加入300uL洗滌液,，靜置浸泡30s，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干,，請立即使用不要讓微孔板干燥,；

4、分別將不同濃度標準品,，實驗樣本或者質控品加入相應孔中,，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔,，室溫孵育2h;

5,、將板內液體吸去，使用洗瓶,、多通道洗板器或自動洗板機洗板,。每孔加洗滌液300uL，然后將板內洗滌液吸去,。 重復操作3次,。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束,，請將板內所有液體吸干或將板倒置,，在吸水紙拍干所有殘留液體；

6,、在每個微孔內加入100uL檢測抗體,。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2h,；

7,、重復第5步洗板操作；

8,、在每個微孔內加入100uLSA-HRP,，室溫孵育20min,。注意避光；

9,、重復第5步洗板操作,；

10、在每個微孔內加入100uL顯色液,，室溫孵育5-30min,，注意避光；

11,、在每個微孔內加入50uL終止液,，孔內溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致,，請輕拍微孔板,，使溶液混合均勻；

12,、加入終止液后30min內,，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長,。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響,；

13,、計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復孔讀數取平均值,，然后減去平均零標準品OD值,。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是,，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應OD值對數生成曲線,，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合,。若樣本經過稀釋,，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

圖9 標準曲線

注： 提供的標準曲線數據僅供參考,，應根據同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量,。

五、類器官活死染色

類器官活死染色是一種用于評估類器官中活細胞與死細胞比例的實驗技術,，對于研究類器官的增殖狀態(tài)和細胞凋亡具有重要意義,。Calcein-AM是一種常用的活細胞熒光標記染料，能夠發(fā)出綠色熒光,，而碘化丙啶(PI)則用于標記死細胞,，發(fā)出紅色熒光,。通過熒光顯微鏡觀察，可以清晰地區(qū)分活細胞和死細胞,。

1,、將共培養(yǎng)后的類器官和懸浮的T細胞分離：小心用槍頭將上清吸棄，留下類器官,；加入適量類器官傳代緩沖液(abs9730),，吹打重懸類器官，待自然沉降后,，吸棄掉上清,，可以根據實際情況選擇清洗次數；

2,、可以參考鏈接類器官原位活死染色實驗攻略進行活死染色,。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題,，歡迎公眾號后臺交流哦,！

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