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概述

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, tme)是由腫瘤相關基質(zhì)細胞、免疫細胞,，以及相應細胞的分泌產(chǎn)物（如細胞因子和趨化因子）和細胞外基質(zhì)(ecm)中的非細胞成分組成的,。腫瘤微環(huán)境為腫瘤提供了良好的生長環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)，促進腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移,，這也是臨床中導致許多個體患者常規(guī)治療失敗的原因,。腫瘤類器官相對于pdx動物模型，體外培養(yǎng)環(huán)境相對單純,，而缺乏腫瘤微環(huán)境的類器官模型,，又很難wan全模擬腫瘤對于藥物的反應性,，特別是免疫細胞隨著腫瘤類器官的培養(yǎng),，會逐漸功能下降、數(shù)量減少，甚至于逐漸消失,。

目前類器官的培養(yǎng)方法是機械破碎法,，使用彈力剪將腫瘤組織剪成1mm³的碎片，加入培養(yǎng)液,，在水平搖床上震蕩培養(yǎng),。研究結(jié)果證明，隨著類器官的培養(yǎng)腫瘤免疫細胞會大量的損失,，腫瘤免疫微環(huán)境受到了很大的破壞,。有文獻報道采用氣液交互法(air-liquid interface, ali)培養(yǎng)組織來源的類器官，可以在一定程度上保留組織原位的免疫微環(huán)境,。今天,，給大家介紹采用ALI方法培養(yǎng)類器官的方法。

培養(yǎng)方法

原代

一,、準備工作

1,、儀器設備

CO₂培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺,、倒置顯微鏡,、臺式冷凍離心機、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床,，醫(yī)用冰箱,、-80℃冰箱、移液器（一套）,、眼科剪,、眼科鑷。

2,、試劑耗材（以肺癌為例）

人肺癌類器官培養(yǎng)試劑盒(abs9443),、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495),、60mm細胞培養(yǎng)皿(abs7005),、100μm濾篩(abs7009)、15mL離心管（尖底,，無菌無酶）(abs7120),、1.5mL EP管若干(abs7119)、細胞小室（PET膜,，6.5mm,，孔徑0.4um,，含24孔板）(abs7280)、金屬冰盒(abs7289),、眼科剪刀,、眼科鑷。

人肺癌類器官培養(yǎng)試劑盒(abs9443)

基質(zhì)膠（低因子,，無酚紅）(abs9495)

二,、操作步驟

 1、細胞小室底層凝膠基質(zhì)的制備

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化,；

（2）槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存,，建議2周內(nèi)用完,。

低溫金屬冰盒(abs7289)

（4）在細胞培養(yǎng)超級凈臺中，用100uL槍頭吸取50uL基質(zhì)膠加入細胞小室（注意鋪展均勻）,，將小室放入24孔板,，將孔板放入培養(yǎng)箱，靜置40-60min直到基質(zhì)膠凝固為止,。

2,、樣本準備

（1）將組織放入含有預冷的（2-8°C）組織保存液E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫(yī)院/實驗室取回,；

（2）將取樣瓶消毒,，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記,，大小,，顏色，軟硬程度,，組織類型等信息,。

3、清洗-剪碎

在60mm細胞培養(yǎng)皿(abs7005)里用2-3mL原代培養(yǎng)緩沖液B浸泡,。用原代培養(yǎng)緩沖液B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm³的組織塊,，轉(zhuǎn)移至15mL離心管,。

4、消化-過濾

（1）向15mL離心管中加入5倍原代組織消化液C（消化液體積：組織體積=5:1,，如果估量組織體積困難,，使用5mL消化液通常足夠）在4℃進行消化15-30min（消化過程中隨時觀察消化情況）。

（2）取少量液體在顯微鏡下觀察,，鏡下觀察到較多的細胞團（5-50個細胞抱團）后,， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液B （緩沖液體積：消化液體積=3:1）終止消化,，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。

（3）使用100μm濾篩(abs7009)進行過濾,，取少量濾液在鏡下進行觀察,。將濾液收集到15mL離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清,。

5,、加膠-點板-加液（這里是整個原代操作的點睛之筆）

（1）準備工作

a. 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b. 槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時,；

c. 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完,。

（2）接種要求

細胞小室（PET膜,，6.5mm，孔徑0.4um,，含24孔板）(abs7280),，每個細胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細胞團混合物。

（3）接種密度

密度建議1：基質(zhì)膠體積：細胞團沉淀體積=25:1（如果估摸細胞團沉淀體積困難,，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：1000個細胞團/50uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡）,，向每個鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細胞團基質(zhì)膠混懸物，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行,，操作熟練以后,，加膠，混勻,，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,。

（5）加液

含組織的上層凝膠凝固以后,，將24孔板放入超凈臺，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基,，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層（如下圖）,，這樣就可以形成ALI微環(huán)境。

（6）將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱,，每2天換一次液,，大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在100um以上,，可進行傳代操作,。

傳代（消化分兩種情況）

一,、細胞小室底層凝膠基質(zhì)的制備

1、基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化,；

2,、槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時,；

3,、融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完,；

4,、在細胞培養(yǎng)超級凈臺中，用100uL槍頭吸取50uL基質(zhì)膠加入細胞小室（注意鋪展均勻）,，將小室放入24孔板,，將孔板放入培養(yǎng)箱，靜置40-60min直到基質(zhì)膠凝固為止,。

二,、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

（1）收集：用移液器吸去外培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基,，向每個細胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠和類器官，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5個細胞小室孔為一組）,。

（2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強,，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）,。

（3）接下來將離心管進行300g,，4℃，離心5min,，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關,。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復上一步洗滌步驟,，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層,、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液,，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a. 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離,；

b. 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉(zhuǎn)速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）,。

2,、類器官消化

（1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次,。此步驟以消化成細胞團為主,，千萬不要消化成單細胞，單細胞類器官存活率低,。如果不確定是否消化適宜,，可吸取數(shù)微升鏡下觀察，如果有較多細胞團可停止消化,。

（2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化,，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留，殘留量<50uL正常,，不影響傳代類器官增殖）

3,、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a. 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b. 槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時,；

c. 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完,。

（2）接種要求

細胞小室（PET膜,，6.5mm，孔徑0.4um,，含24孔板）(abs7280),，每個細胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細胞團混合物,。

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如,，細胞小室收集5孔,，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量50*10=500uL,；

密度建議2：1000個細胞團/50uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）；

注意：不管是按密度建議1還是,，密度建議2,，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍,。

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，向每個鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細胞團基質(zhì)膠混懸物,，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行，操作熟練以后,，加膠,，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）,。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠。

（5）加液

含組織的上層凝膠凝固以后,，將24孔板放入超凈臺,，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層,，這樣就可以形成ALI微環(huán)境,。

（6）將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱，每2天換一次液,，大概7-10天,，多數(shù)類器官直徑在100um以上，可進行傳代操作,。

三,、類器官數(shù)量不足或體積較小時：

1、類器官收集,、吹打,、洗滌

（1）收集：用移液器吸去下培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，向每個細胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠和類器官,，轉(zhuǎn)移到下培養(yǎng)孔,。

（2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣鏡下觀察有較多細胞團時可停止吹打）,；

（3）洗滌：24孔板，每5孔為一組,，收集在15mL離心管中,，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除）,，4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強,，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）,。

（4）接下來將離心管進行300g,，4℃，離心5min,，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留細胞團沉淀即可,。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關,。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復上一步洗滌步驟,，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層,、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細胞團混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細胞團混懸液,，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a. 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b. 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉(zhuǎn)速可適當提高（最高不要超過500g）,，離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2,、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a. 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化,；

b. 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時,；

c. 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存,，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

細胞小室（PET膜,，6.5mm,，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280),，每個細胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細胞團混合物,。

（3）接種密度

密度建議1： 對于類器官數(shù)量較少的情況，為了維持生長所需的旁分泌信號,，需要2-3孔富集到1孔,，例如，24孔板收集6孔,，2孔富集1孔,，鋪3孔，需要的基質(zhì)膠量50*3=150uL,。

密度建議2：1000個細胞團/50uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠,，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，向每個鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細胞團基質(zhì)膠混懸物,，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行，操作熟練以后,，加膠,，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）,。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠。

（5）加液

含組織的上層凝膠凝固以后,，將24孔板放入超凈臺,，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環(huán)境,。

（6）將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱,，每2天換一次液，大概7-10天,，多數(shù)類器官直徑在100um以上,，可進行傳代操作。

凍存

凍存要領：

類器官不需要消化（消化后的類器官復蘇活率低）,；

在類器官指數(shù)增長期凍存（等到該傳代的時候類器官活性比指數(shù)期差）,，也就傳代后的Day3-Day4，多數(shù)類器官直徑在100um-200um,，這個時機選擇凍存。

一,、類器官收集及洗滌

1,、收集：用移液器吸去下培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，向每個細胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠和類器官,，收集在15mL離心管中（24孔板，每5個細胞小室孔為一組）,。

2,、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除）,，4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強,，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）,。

3,、接下來將離心管進行300g，4℃,，離心5min,，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復上一步洗滌步驟,，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層,、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液,，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a. 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離,；

b. 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉(zhuǎn)速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）,。

二,、類器官凍存

1、凍存密度,，以細胞小室（PET膜,，6.5mm，孔徑0.4um,，含24孔板）(abs7280)為例

密度建議1：2個細胞小室孔/mL凍存液

密度建議2：500個類器官/mL凍存液（如果想計數(shù)凍存,，可以參照此密度建議）

2、添加適量類器官凍存液 F,，輕柔吹打重懸,，建議立即進行凍存。（放置太久,，DMSO對類器官有損傷）

3,、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐,。

     手動凍存：4℃冰箱放置30min,，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜,，第二天取出放入液氮罐,。

復蘇

一、實驗前準備

1,、將水浴鍋預熱至37℃,；

2,、細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面,；

3,、在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管,、培養(yǎng)板等,。

二、細胞小室底層凝膠基質(zhì)的制備

1,、基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化,；

2、槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時,；

3、融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存,，建議2周內(nèi)用完,；

4、在細胞培養(yǎng)超級凈臺中,，用100uL槍頭吸取50uL基質(zhì)膠加入細胞小室（注意鋪展均勻），將小室放入24孔板,，將孔板放入培養(yǎng)箱,，靜置40-60min直到基質(zhì)膠凝固為止。

三,、取出凍存管

1,、根據(jù)類器官凍存記錄按標簽找到所需類器官的編號；

2,、從液氮罐中取出凍存盒,，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號,。

四,、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中解凍,，并要不斷地搖動,，使管中地液體迅速融化；

2,、約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內(nèi),。

五,、將類器官凍存液移入15mL離心管,，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻,，300g 4℃離心5min,，棄上清。

六,、加膠-點板-加液

1,、準備工作

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

（2）槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時,；

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完,。

2,、復蘇要求

細胞小室（PET膜，6.5mm,，孔徑0.4um,，含24孔板）(abs7280)，每個細胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細胞團混合物,。

3,、復蘇密度

復蘇密度建議1：1:1接種（原來凍了幾個細胞小室孔就復蘇幾個細胞小室孔）；

復蘇密度建議2：500個類器官/50uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

4,、加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡）,，向每個鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細胞團基質(zhì)膠混懸物，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行,，操作熟練以后,，加膠，混勻,，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,。

5,、加液

含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺,，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基,，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環(huán)境,。

6,、培養(yǎng)

將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱,，每2天換一次液，大概10-14天,，多數(shù)類器官直徑在100um以上,，可進行傳代操作。

今天講解就到這了,，大家如有實驗問題,，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺交流哦！

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