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類器官原位活死染色實驗攻略

閱讀:752      發(fā)布時間:2024-4-30
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概述

 

在類器官的培養(yǎng)過程中,,如果我們想了解類器官的增殖及凋亡狀態(tài),可以通過對活細胞和死細胞進行熒光染色,,通過熒光顯微鏡拍照觀察,。

 

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑,發(fā)綠色熒光 (Ex=490nm, Em=515nm),。因其在傳統(tǒng)的Calcein(鈣黃綠素)基礎上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團,,增加了疏水性,使其能夠輕易穿透活細胞膜,。一旦進入細胞后,,Calcein-AM(本身不發(fā)熒光)被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein,從而被滯留在細胞內并發(fā)出強綠色熒光,。與其它同類試劑(如BCECF-AM和CFDA)相比,,由于Calcein-AM細胞毒性極低,是很適合用于活細胞染色的熒光探針,,而且不會抑制任何的細胞功能,,如增殖和淋巴球的趨化性。        

 

由于死細胞缺乏酯酶,,Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記,。因此,Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶(PI)等聯(lián)合使用,,同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色,。碘化丙啶(Propidium iodide, PI)不能穿過活細胞的細胞膜,僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核,,并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(Ex=535nm, Em=617nm),,因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā),,因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞,。而用545nm激發(fā),僅可觀察到死細胞,。

 

原理

 

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料,,來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記,,從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系,,以24孔板,,每孔25uL類器官基質膠凝聚物為例,每孔添加500uL染色工作液進行染色,。

 

活細胞/死細胞雙染試劑盒(abs50056)


組分

名稱

規(guī)格

保存

A

Calcein-AM Solution(2mM)

50μL

-20℃避光干燥保存

B

PI Solution(1.5mM)

150μL

-20℃避光干燥保存

C

10×Assay Buffer 

50mL

-20℃保存,,經(jīng)常使用可放在4℃保存。




 

實驗步驟

 

一,、工作液的配制:

 

1,、1×Assay Buffer(反應緩沖液)的配制 從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer,根據(jù)單次用量無菌條件取出適量,,用去離子水(dH2O)做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer,。

2、1×染色工作液的配制

(1)先將低溫保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液(1.5mM)回到室溫20-30min,。 注意:第一次使用可對母液進行分裝,,以減少反復凍融次數(shù)。

(2)取5μL Calcein-AM溶液(2mM)和15μL PI 溶液(1.5mM)加入5mL 1×Assay Buffer,,充分混勻,。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為2μM,PI的工作液濃度為4.5μM,。

注意:由于不同種類器官的最佳染色條件不同,,初次實驗建議做梯度實驗,以確定Calcein-AM和PI的最適濃度,。梯度篩選的原則為使用min的探針濃度得到較好的熒光結果,。可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度,。

 

a. 用0.1%皂素或者0.1-0.5%digoxin孵育類器官1h,,或者用70%乙醇孵育類器官1h,從而制備死類器官,;

b. 用0.1-10μM的PI溶液進行死類器官染色,,以得到僅僅對細胞核染色,而不會對細胞質染色的最佳工作濃度,;

c. 用0.1-10μM的Calcein-AM進行死類器官染色,,以得到不會對細胞質染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色,,去觀察活細胞是否能被染色,。

 

二、染色步驟:

 

 以24孔板,,每孔25uL類器官基質膠凝聚物為例,,檢測時只需棄除類器官培養(yǎng)液,保留孔板內25μL類器官基質膠凝聚物,,加入染色工作液即可,。

 

1、將類器官培養(yǎng)基吸棄,,加入PBS清洗2-3遍,,以充分去除殘留的酯酶活性,然后棄除PBS,;

2,、每孔加入500μL染色工作液,混勻,,37℃孵育1h,;

3、熒光顯微鏡下使用490±10nm激發(fā)濾片同時檢測活細胞(黃綠色熒光)以及死細胞(紅色熒光),。另外,,使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測,。

 

注意事項

1,、由于Calcein-AM對濕度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,,必須緊緊密封蓋子,。建議根據(jù)單次用量,分裝密封保存,。

2,、由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差,此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,,并且在當天用完,。

3、碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,,操作時一定要注意防護,。若接觸到皮膚,需要立即用自來水清洗,。

4,、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

 

染色效果圖展示

 

一,、人肝細胞癌類器官明場圖




人肝細胞癌類器官擴增過程(由少到多)

 

二、人肝細胞癌類器官活死染色視頻


 

三,、人肝細胞癌類器官活死染色圖


人肝細胞癌類器官活細胞,、死細胞,、活死細胞染色合并圖


人肝細胞癌類器官活死細胞染色合并圖

 

今天講解就到這了,大家如有實驗問題,,歡迎私聊交流哦,!

 

類器官培養(yǎng)產(chǎn)品推薦


貨號

品名

規(guī)格

abs50056

活細胞/死細胞雙染試劑盒

500T

abs9495

基質膠(低因子、無酚紅)

1.5mL×4

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abs9858

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Absin產(chǎn)品線:
爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC,、IHC,、凋亡、ELISA,、ChIP,、Co-IP、TR-FRET,、生化檢測,、殘留檢測、多因子檢測),;細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質膠,,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒,;分子(mRNA合成服務+提取試劑盒),;化合物大包裝;輔助試劑,、耗材/儀器,、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27,、N2,、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE,、百日咳毒素PTX,、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...


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