概述
在類器官的培養(yǎng)過程中,,如果我們想了解類器官的增殖及凋亡狀態(tài),可以通過對活細胞和死細胞進行熒光染色,,通過熒光顯微鏡拍照觀察,。
Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑,發(fā)綠色熒光 (Ex=490nm, Em=515nm),。因其在傳統(tǒng)的Calcein(鈣黃綠素)基礎上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團,,增加了疏水性,使其能夠輕易穿透活細胞膜,。一旦進入細胞后,,Calcein-AM(本身不發(fā)熒光)被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein,從而被滯留在細胞內并發(fā)出強綠色熒光,。與其它同類試劑(如BCECF-AM和CFDA)相比,,由于Calcein-AM細胞毒性極低,是很適合用于活細胞染色的熒光探針,,而且不會抑制任何的細胞功能,,如增殖和淋巴球的趨化性。
由于死細胞缺乏酯酶,,Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記,。因此,Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶(PI)等聯(lián)合使用,,同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色,。碘化丙啶(Propidium iodide, PI)不能穿過活細胞的細胞膜,僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核,,并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(Ex=535nm, Em=617nm),,因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā),,因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞,。而用545nm激發(fā),僅可觀察到死細胞,。
原理
本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料,,來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記,,從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系,,以24孔板,,每孔25uL類器官基質膠凝聚物為例,每孔添加500uL染色工作液進行染色,。
活細胞/死細胞雙染試劑盒(abs50056)
組分 | 名稱 | 規(guī)格 | 保存 |
A | Calcein-AM Solution(2mM) | 50μL | -20℃避光干燥保存 |
B | PI Solution(1.5mM) | 150μL | -20℃避光干燥保存 |
C | 10×Assay Buffer | 50mL | -20℃保存,,經(jīng)常使用可放在4℃保存。 |
實驗步驟
一,、工作液的配制:
1,、1×Assay Buffer(反應緩沖液)的配制 從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer,根據(jù)單次用量無菌條件取出適量,,用去離子水(dH2O)做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer,。
2、1×染色工作液的配制
(1)先將低溫保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液(1.5mM)回到室溫20-30min,。 注意:第一次使用可對母液進行分裝,,以減少反復凍融次數(shù)。
(2)取5μL Calcein-AM溶液(2mM)和15μL PI 溶液(1.5mM)加入5mL 1×Assay Buffer,,充分混勻,。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為2μM,PI的工作液濃度為4.5μM,。
注意:由于不同種類器官的最佳染色條件不同,,初次實驗建議做梯度實驗,以確定Calcein-AM和PI的最適濃度,。梯度篩選的原則為使用min的探針濃度得到較好的熒光結果,。可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度,。
a. 用0.1%皂素或者0.1-0.5%digoxin孵育類器官1h,,或者用70%乙醇孵育類器官1h,從而制備死類器官,;
b. 用0.1-10μM的PI溶液進行死類器官染色,,以得到僅僅對細胞核染色,而不會對細胞質染色的最佳工作濃度,;
c. 用0.1-10μM的Calcein-AM進行死類器官染色,,以得到不會對細胞質染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色,,去觀察活細胞是否能被染色,。
二、染色步驟:
以24孔板,,每孔25uL類器官基質膠凝聚物為例,,檢測時只需棄除類器官培養(yǎng)液,保留孔板內25μL類器官基質膠凝聚物,,加入染色工作液即可,。
1、將類器官培養(yǎng)基吸棄,,加入PBS清洗2-3遍,,以充分去除殘留的酯酶活性,然后棄除PBS,;
2,、每孔加入500μL染色工作液,混勻,,37℃孵育1h,;
3、熒光顯微鏡下使用490±10nm激發(fā)濾片同時檢測活細胞(黃綠色熒光)以及死細胞(紅色熒光),。另外,,使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測,。
注意事項
1,、由于Calcein-AM對濕度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,,必須緊緊密封蓋子,。建議根據(jù)單次用量,分裝密封保存,。
2,、由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差,此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,,并且在當天用完,。
3、碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,,操作時一定要注意防護,。若接觸到皮膚,需要立即用自來水清洗,。
4,、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作,。
染色效果圖展示
一,、人肝細胞癌類器官明場圖
人肝細胞癌類器官擴增過程(由少到多)
二、人肝細胞癌類器官活死染色視頻
三,、人肝細胞癌類器官活死染色圖
人肝細胞癌類器官活細胞,、死細胞,、活死細胞染色合并圖
人肝細胞癌類器官活死細胞染色合并圖
今天講解就到這了,大家如有實驗問題,,歡迎私聊交流哦,!
類器官培養(yǎng)產(chǎn)品推薦
貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
abs50056 | 活細胞/死細胞雙染試劑盒 | 500T |
abs9495 | 基質膠(低因子、無酚紅) | 1.5mL×4 |
abs9786 | Organotial人肝膽管癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9544 | Organotial人正常肝類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9778 | Organotial人膀胱癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9773 | Organotial人食管癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9590 | Organotial人宮頸癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9739 | Organotial人腦膠質瘤類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9589 | Organotial人鼻咽癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9743 | Organotial人前列腺癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9858 | Organotial人喉癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
Absin產(chǎn)品線:
爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC,、IHC,、凋亡、ELISA,、ChIP,、Co-IP、TR-FRET,、生化檢測,、殘留檢測、多因子檢測),;細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質膠,,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒,;分子(mRNA合成服務+提取試劑盒),;化合物大包裝;輔助試劑,、耗材/儀器,、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27,、N2,、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE,、百日咳毒素PTX,、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
立即詢價
您提交后,,專屬客服將第一時間為您服務