摘要：

盡管細(xì)胞外囊泡(EVs)在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用，但它們的不同種群及其分泌機(jī)制尚未表征：EVs如何以及在何種程度上形成為內(nèi)吞隔室腔內(nèi)囊泡(外泌體)或在質(zhì)膜(PM)上形成囊泡(ectosomes)仍不清楚,。該研究跟蹤了EV標(biāo)志物CD9和CD63從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到它們的駐留區(qū)室,，分別是PM和晚期內(nèi)體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,。在它們最終分離之前，觀察到兩個(gè)地方的瞬時(shí)共定位,。CD9和穩(wěn)定在PM的突變CD63在EV中比CD63更豐富地釋放,。因此，在HeLa細(xì)胞中,，ectosomes比外泌體分泌更多,。通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析和對(duì)內(nèi)體pH中和的差異反應(yīng)，確定了一些可能對(duì)外泌體(LAMP1)或ectosomes(BSG,、SLC3A2)具有特異性的表面蛋白,。該研究工作為任何細(xì)胞類型中外泌體和小ectosomes的分子和功能區(qū)分開辟了道路。

引言：

所有細(xì)胞都會(huì)在其環(huán)境中釋放膜包裹的囊泡,，統(tǒng)稱為細(xì)胞外囊泡(EV),。這些EV包含來(lái)自其起源細(xì)胞的一組選定的脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì),，因此可以將一系列復(fù)雜的信息傳輸?shù)街車蜻h(yuǎn)處的細(xì)胞,。EV可以通過從原核和真核細(xì)胞的質(zhì)膜(PM)直接向外出芽形成。在真核細(xì)胞中,，EV也可以首先作為內(nèi)吞途徑(MVB)的內(nèi)部多泡隔室的腔內(nèi)囊泡形成,，然后在這些隔室與PM融合時(shí)分泌。為了闡明命名法,，最近建議專門針對(duì)MVB衍生的EV使用術(shù)語(yǔ)“外泌體",，而不是針對(duì)所有小型EV；另一方面,，PM衍生的EV被稱為各種名稱,，例如微泡、微?；虬怏w,。

由于它們?cè)诓煌膩喖?xì)胞位點(diǎn)形成，外泌體和胞外體可能包含不同組的特定貨物,，因此具有不同的功能,。然而，由于難以將生物流體或細(xì)胞條件培養(yǎng)基中存在的相同大小的外泌體與外泌體分離,，缺乏區(qū)分外泌體與胞外體的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記,，以及分子機(jī)制和具有對(duì)一個(gè)或另一個(gè)特異性的工具。

研究結(jié)果：

1,、CD63和CD9存在于兩個(gè)不同的和一個(gè)共同的EV群體中

使用HeLa細(xì)胞去研究分析EV的分布,，免疫熒光結(jié)果表明CD63主要位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。相反,，CD9主要存在于質(zhì)膜上,，但也存在于罕見的暗淡細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中,。在穩(wěn)態(tài)下沒有觀察到兩種蛋白質(zhì)的明顯共定位。

2,、CD63和CD9短暫地通過晚期內(nèi)體和PM

pHluorin在酸性條件下實(shí)際上是無(wú)熒光的,，但在中性pH時(shí)發(fā)出熒光，因此使其成為觀察酸性晚期胞內(nèi)MVB與質(zhì)膜融合的理想報(bào)告分子,。由于細(xì)胞外部環(huán)境處于中性pH，因此在融合過程中會(huì)發(fā)生酸到中性的轉(zhuǎn)換,。免疫電鏡表明在所有時(shí)間點(diǎn),，大多數(shù)MVB和溶酶體僅包含CD63而不是CD9。

3,、與CD63不同,，CD9和CD63-YA具有相似的PM定位和內(nèi)化動(dòng)力學(xué)

溶酶體靶向基序進(jìn)行突變?yōu)镃D63-YA，CD63-WT-eGFP或CD63-YA-eGFP RUSH質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞,；結(jié)果顯示,，在穩(wěn)定狀態(tài)下，與CD63-WT相反,，CD63-YA主要位于細(xì)胞外圍和一些小的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中,。動(dòng)力監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，突變體CD63-YA 不會(huì)進(jìn)入酸性內(nèi)部隔間,；同時(shí),，用生物素處理后，結(jié)果顯示CD9和CD63-YA在添加生物素后約1h達(dá)到相似的表面(AF647)/總(GFP)熒光強(qiáng)度比為1,，在穩(wěn)態(tài)下進(jìn)一步增加至約2,；相比之下，對(duì)于CD63,，最大表面/總比值增加但保持低于1,，直到添加生物素后2h，并在2h和穩(wěn)態(tài)之間下降,，CD63-YA和CD9表現(xiàn)相似并在質(zhì)膜上積累,。

4、PM蛋白在CD9-EV中富集,，而內(nèi)體/溶酶體和PM跨膜蛋白都在CD63-EV中富集

為了更好地確定CD63+和CD9+EV的起源,，并鑒定PM或內(nèi)體釋放的EV的特定標(biāo)志物，研究者進(jìn)行了定量質(zhì)譜分析,；同步分泌的CD63或CD9 EV的定量質(zhì)譜分析揭示了質(zhì)膜和內(nèi)體衍生的EV的特征,，PM蛋白在CD9-EV中富集，而內(nèi)體/溶酶體和PM 跨膜蛋白都在CD63-EV中富集,。

研究結(jié)論：

這項(xiàng)工作旨在確定含有不同四跨膜蛋白的EV的實(shí)際外泌體或外泌體性質(zhì),。為了確定這些細(xì)胞釋放的EV的亞細(xì)胞起源,，研究者通過時(shí)間控制的方式跟蹤四跨膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，從它們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的初始合成到它們?cè)贓V中的分泌,。研究結(jié)果表明,，CD63和CD9都可以在質(zhì)膜形成的小ectosomes中釋放，并且在HeLa細(xì)胞中,，外泌體代表小EVs(sEVs)的一個(gè)小亞群,，它們攜帶CD63和其他晚期內(nèi)體分子，如LAMP1/2,。它們的分泌特別容易受到內(nèi)體pH值的中和,。BSG和SLC3A2被鑒定為HeLa細(xì)胞中ectosomes分泌的特定標(biāo)記物，相反對(duì)內(nèi)體pH中和不敏感,。有趣的是,，CD81是另一種常用作外泌體和/或小EV標(biāo)記物的四跨膜蛋白，其行為類似于CD9而不是CD63,。此處確定的外泌體與ectosomes的特異性標(biāo)志物和分子機(jī)制將為進(jìn)一步研究以破譯它們各自的功能鋪平道路,。

參考文獻(xiàn)：

標(biāo)題：Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9

期刊：Nat Commun

發(fā)表時(shí)間：2021年

影響因子：17.694

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