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概述

近年來使用3D腫瘤球&腫瘤類器官模型在大型化合物庫中的高通量藥物篩選、檢測單藥或多藥濃度等方面,，展現(xiàn)出能夠幫助研究者快速篩選出藥物敏感性強,、反應(yīng)性好、效果優(yōu)的癌癥適應(yīng)癥藥物的能力,。在2D細胞藥敏活性檢測中,，CCK8法應(yīng)用廣泛，然而在3D腫瘤球&腫瘤藥物敏感活性中,，ATP熒光法比CCK8法檢測更準確,，今天小愛帶大家了解檢測攻略。

ATP生物發(fā)光技術(shù)原理

本試劑盒采用生物發(fā)光(bioluminescent)法,，利用Firefly luciferase（螢火蟲熒光素酶）催化底物—熒光素的轉(zhuǎn)化,，高效利用ATP的能量，發(fā)射出光子。發(fā)光信號與存在的ATP量呈正比,，而ATP與存在于類器官中的細胞數(shù)目直接呈正比,，有效檢測3D腫瘤球&類器官活性。

本試劑盒為多孔板而設(shè)計,，是進行自動化高通量篩選(HTS) ,，3D腫瘤球&類器官增殖和毒性分析的理想選擇。均質(zhì)檢測步驟就是將單一試劑直接加入含有類器官培養(yǎng)基的孔板中,，無需去除基質(zhì)膠,。

均質(zhì)檢測的"加樣-混合-檢測" 的操作方案使得3D腫瘤球&類器官裂解和產(chǎn)生的發(fā)光信號與存在的ATP量成正比，而ATP量直接與類器官中的細胞數(shù)量成正比,。特殊的均質(zhì)檢測方案避免了那些需要多個步驟的ATP檢測方法可能會引入的誤差。

產(chǎn)品組成

注意：產(chǎn)品建議現(xiàn)配現(xiàn)用

產(chǎn)品特點

1）簡化了類器官活性檢測步驟：均質(zhì)的"加樣-混合-檢測"方案減少了其它同類檢測所需的操作步驟；

2）類器官用量更少：可準確地檢測到低于常用的比色法和熒光法的檢測低限的細胞數(shù),。 減少了每個檢測反應(yīng)所需的細胞數(shù),；

3）迅速獲得結(jié)果：加入試劑后10min就能獲得數(shù)據(jù)；

4）可自行選擇檢測方案：可用于多種類型的多孔板操作,?？捎冒l(fā)光檢測儀或CCD成像設(shè)備記錄數(shù)據(jù)；

5）可連續(xù)處理培養(yǎng)板：發(fā)光信號穩(wěn)定,，樣品可進行批量處理,。

使用方法

1、類器官的準備：

使用適合進行化學發(fā)光檢測的96孔板（底和蓋子透明,，孔壁不透,，推薦貨號：abs7242），每孔接種5uL-10uL類器官基質(zhì)膠混懸物,，放培養(yǎng)箱半小時以上,，待凝固后加入100uL類器官培養(yǎng)基（如使用384孔板，每孔接種2.5μL-4μL類器官基質(zhì)膠混懸物,，具體用量視不同類型的384孔板而定）,，并確保檢測時每孔的細胞數(shù)量在5萬個以內(nèi)（如使用384孔板宜控制在1萬個以內(nèi)），同時設(shè)置不含類器官的基質(zhì)膠培養(yǎng)液孔作為陰性對照,，按照類器官培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)類器官,。如有需要，可加入藥物處理類器官,。此外,，如有必要，也可以設(shè)置類器官的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果,。

2,、試劑準備：

1管凍干粉加入1管10mL buffer里，混勻避光待用,。

注：溶解后盡快使用,，-80℃，避光保存,，有效期一個月,。

1）溶解Organoid ATP發(fā)光法檢測試劑，如有必要可適當分裝該試劑,；

2）按照96孔板每孔100μL（384孔板每孔25μL）的量,，取適量Organoid ATP發(fā)光法檢測試劑，平衡至室溫,。

3,、類器官活力檢測：

1）取出類器官培養(yǎng)板在室溫平衡10min（通常不宜超過30min）；

2）將96孔板每孔里的類器官培養(yǎng)基去除,，每孔加入100μL Organoid ATP發(fā)光法檢測試劑（384孔板每孔25μL）,； 注：無需去除基質(zhì)膠。

3）室溫劇烈振蕩（微孔板恒溫振蕩器,，推薦貨號：abs72034）5min使類器官充分裂解,；

4）室溫（約25℃）孵育10min，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定,；

5）使用具有檢測化學發(fā)光功能的多功能酶標儀進行化學發(fā)光檢測,。請根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25- 1s或更長時間,，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進行適當?shù)恼{(diào)整,；

6）根據(jù)化學發(fā)光讀數(shù)直接計算類器官的相對活力，或根據(jù)ATP標準曲線計算出ATP的量從而計算出類器官的相對活力,。

注：檢測效果因類器官的種類不同而有所不同,，對于一些ATP含量特別高的類器官，在細胞數(shù)量達到50,000個后可能會不呈線性相關(guān),，但化學發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高,。

常見問題

1、熒光素酶的活性對溫度比較敏感,，所以反應(yīng)前類器官和檢測試劑均需平衡至室溫后再進行測定,。檢測試劑請混勻后使用；

2,、本試劑盒的檢測試劑中含有熒光素酶,，反復凍融會導致其逐漸失活,。為取得良好的使用效果，第一次溶解后可適當分裝保存,，但需注意分裝的容器不能有ATP污染,；

3、待測藥物的溶劑含量較高時可能會干擾熒光素酶反應(yīng),，從而影響化學發(fā)光信號,。可以通過設(shè)置含有溶劑的類器官培養(yǎng)液對照孔排除溶劑的干擾,；

4,、檢測時須使用適合于類器官培養(yǎng)的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板,，相鄰孔之間會產(chǎn)生相互干擾,；

5、類器官接種密度,，以24傳96孔板為例,。

傳代前狀態(tài)：24孔板，每孔25uL基質(zhì)膠類器官凝聚物,，500uL培養(yǎng)液

傳代比例：類器官1:2傳代

接種方式：24孔板傳96孔板

96孔接種要求：每孔5uL基質(zhì)膠類器官凝聚物,，100uL培養(yǎng)液

接種孔數(shù)：24孔板收集3孔類器官傳代,，按1:2傳代比例要傳6孔,，每孔點膠25uL，總點膠量6*25=150uL,，此時傳于96孔板,，每孔點膠量5uL，總點孔數(shù)150/5=30孔

圖 ICC（膽管癌）類器官96孔鋪板密度圖

檢測案例

1,、類器官藥敏-人肝膽管癌(ICC)

結(jié)論：人肝膽管癌(ICC)類器官對Oxaliplatin,、Lenvatinib、Larotrectinib,、Regorafenib不敏感,；對Cisplatin、Paclitaxel敏感

2,、類器官藥敏-人肺癌

結(jié)論：人肺癌類器官對drug1一般敏感,； 對drug2敏感

3、類器官藥敏-人胰腺癌

結(jié)論：人胰腺癌類器官對Irinotecan,、Oxaliplatin一般敏感,；對Paclitaxel、Gemcitabine敏感,；兩個病人表現(xiàn)出的藥敏效果一致,。

4,、類器官藥敏-人胰腺癌

結(jié)論：人胰腺癌類器官對Larotrectinib、Oclacitinib,、Lenvatinib,、5-Fluorouracil不敏感一般敏感；兩個病人表現(xiàn)出的藥敏效果一致,。

今天講解就到這了,，大家如有類器官活力檢測問題，歡迎入群交流哦,！

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