概述：
生命誕生于3D環(huán)境,，所以傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方法,，雖然可以保證細(xì)胞的生長和對外界刺激產(chǎn)生生理反應(yīng)，但是和實(shí)際生活環(huán)境的巨大差異會導(dǎo)致大部分生理功能受限,。比如,，2D培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞間的相互作用是XY軸的，只是細(xì)胞層之間的作用,，缺乏Z軸方向的影響,，這樣就沒有養(yǎng)料,、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用。而3D培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞可以變成細(xì)胞球,，從而可以體現(xiàn)出Z軸細(xì)胞之間的力作用和各種物質(zhì)的滲透梯度,，和體內(nèi)的差異相較2D細(xì)胞層會大大縮小，從而提高體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞來高通量的篩選新的有效的藥物對于挽救癌癥病人非常重要,。
本期小愛帶大家學(xué)習(xí)腫瘤球培養(yǎng)過程：以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7為例制備3D多細(xì)胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對其進(jìn)行詳細(xì)表征,。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作
1,、提前24h取12mL DMEM(abs9483)和RPMI 1640(abs9484)培養(yǎng)基（含10%FBS(abs972),，下同）于50mL離心管內(nèi)，置于4℃冰箱中預(yù)冷,；
2,、將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠(abs9490)提前24h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態(tài),；
3,、將無菌的1mL移液器槍頭放入無菌50mL離心管內(nèi)，置-20℃冰箱預(yù)冷,。
二,、瓊脂糖包被96孔板
1、準(zhǔn)確量取6mL RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）于2個10mL的注射玻璃瓶內(nèi),，加入90mg瓊脂糖(abs44056213),，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30min；
2,、加熱結(jié)束后,，將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi)，115℃滅菌30min,；
3,、滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺內(nèi),。將注射瓶內(nèi)的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中,，用多通道移液器以每孔60μL的量加入96孔板內(nèi)。
注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時會凝固,，因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)并迅速加入至96孔板中,。
此外，為保證加樣時瓊脂糖不冷卻,，需要同時滅菌加樣槽和100μL的移液器槍頭,。
4,、加入完成后，96孔板要保持水平約30min使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固,。
三,、配置含Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞懸液
1、取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞（或MCF-7細(xì)胞）,，胰蛋白酶(abs47014938)消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，用RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.0×105cells/mL，備用,；
2,、將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內(nèi)，將RPMI 1640培養(yǎng)基以及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上,。
注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固,，因此在操作過程中一定要保持低溫。
3,、將預(yù)冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺內(nèi),。根據(jù)計(jì)算量（2.5%，v/v）用移液器將300μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12mL RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi),，迅速混勻,。
注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預(yù)冷,。
4,、加入步驟1中的細(xì)胞懸液（約600μL），使細(xì)胞濃度為10000cells/mL,，迅速混勻,，備用；
四,、將細(xì)胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板
1,、將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞懸液放入加樣槽內(nèi)，用多通道移液器吸取200μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi),；
2,、采用微孔板離心機(jī)(abs72035)進(jìn)行離心，離心條件為4℃,，1000×g,，10min；
注意：離心96孔板時為保持無菌,，將96孔板的周圍用封口膜封住,。
3、離心完成后,，取出96孔板,，摘下封口膜,，噴灑酒精后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。整個培養(yǎng)流程如圖1所示,；
圖1
4,、在培養(yǎng)的第3、5和7天,，更換孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態(tài),；
圖2
5、若要采用3D多細(xì)胞腫瘤球進(jìn)行藥物試驗(yàn),，在培養(yǎng)7天后,，用移液器取出孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基，加入100μL給藥溶液,，然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長狀況（圖2）,。
五、3D多細(xì)胞腫瘤球的表征
1,、倒置顯微鏡觀察3D多細(xì)胞腫瘤球形態(tài)：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可；
2,、激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球,，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定,，并用Hoechst 33258(abs47047617)對細(xì)胞核進(jìn)行染色,，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖3）。
圖3
3,、環(huán)境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球,，用PBS(abs962)清洗3遍后，固定干燥后進(jìn)行環(huán)境掃描電鏡觀察（圖4）,。
圖4
常見問題：
在實(shí)踐中,，我們常常面臨細(xì)胞無法成球狀的問題。下面我們探討3D細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞不能成球狀的原因,，以及針對這些問題的解決方法,。
一、細(xì)胞類型和特性：
細(xì)胞的類型和特性是影響其在3D環(huán)境中形成球狀結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素之一,。不同類型的細(xì)胞具有不同的自組織和黏附性能,，可能更適合形成其他類型的3D結(jié)構(gòu)，如片狀,、管狀等,。
解決方法：在進(jìn)行3D培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前，必須仔細(xì)選擇適合自組織的細(xì)胞類型,。對于不易形成球狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞,，可以嘗試使用誘導(dǎo)因子或基因調(diào)控方法來促進(jìn)其自組織能力,。
二、細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 缺乏或不適當(dāng)：
細(xì)胞成球狀通常需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)支持,。如果培養(yǎng)基中的ECM成分不足或不適當(dāng),，細(xì)胞可能無法形成球狀。
解決方法：合理設(shè)計(jì)培養(yǎng)基中的ECM成分,，確保細(xì)胞有足夠的支持來形成球狀結(jié)構(gòu),。此外，可以考慮添加外源性ECM支持物質(zhì),，如適當(dāng)?shù)?strong>基質(zhì)蛋白,、生物活性的材料等。
三,、細(xì)胞密度不足：
細(xì)胞成球狀可能需要足夠的細(xì)胞密度來支持細(xì)胞間的相互作用和自組織,。如果細(xì)胞密度過低，可能會影響球狀結(jié)構(gòu)的形成
解決方法：優(yōu)化細(xì)胞接種密度,，確保足夠的細(xì)胞數(shù)參與自組織過程,。
四、培養(yǎng)條件不適當(dāng)：
培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基成分,、溫度,、氧氣濃度等可能會影響細(xì)胞成球狀的能力。不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件可能阻礙了細(xì)胞的自組織能力,。
解決方法：通過優(yōu)化培養(yǎng)條件,，創(chuàng)造一個更有利于細(xì)胞自組織的環(huán)境，例如調(diào)整培養(yǎng)基成分,、溫度和氣體濃度,。
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