概述：
生命誕生于3D環(huán)境,，所以傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)方法,，雖然可以保證細胞的生長和對外界刺激產(chǎn)生生理反應，但是和實際生活環(huán)境的巨大差異會導致大部分生理功能受限,。比如,，2D培養(yǎng)環(huán)境下的細胞間的相互作用是XY軸的，只是細胞層之間的作用,，缺乏Z軸方向的影響,，這樣就沒有養(yǎng)料、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用,。而3D培養(yǎng)環(huán)境下細胞可以變成細胞球,，從而可以體現(xiàn)出Z軸細胞之間的力作用和各種物質的滲透梯度，和體內的差異相較2D細胞層會大大縮小,，從而提高體外細胞實驗的準確性,。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細胞來高通量的篩選新的有效的藥物對于挽救癌癥病人非常重要。
本期小愛帶大家學習腫瘤球培養(yǎng)過程：以乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7為例制備3D多細胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對其進行詳細表征,。
實驗步驟：
一、實驗前準備工作
1,、提前24h取12mL DMEM(abs9483)和RPMI 1640(abs9484)培養(yǎng)基（含10%FBS(abs972),，下同）于50mL離心管內，置于4℃冰箱中預冷,；
2,、將分裝好的Matrigel基質膠(abs9490)提前24h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態(tài),；
3,、將無菌的1mL移液器槍頭放入無菌50mL離心管內，置-20℃冰箱預冷,。
二,、瓊脂糖包被96孔板
1、準確量取6mL RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）于2個10mL的注射玻璃瓶內,，加入90mg瓊脂糖(abs44056213),，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內加熱溶解30min；
2,、加熱結束后,，將注射瓶放入滅菌鍋內，115℃滅菌30min,；
3,、滅菌完成后,，迅速取出注射瓶放入超凈臺內。將注射瓶內的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中,，用多通道移液器以每孔60μL的量加入96孔板內,。
注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時會凝固，因此從滅菌鍋內取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉移至超凈臺內并迅速加入至96孔板中,。
此外,，為保證加樣時瓊脂糖不冷卻，需要同時滅菌加樣槽和100μL的移液器槍頭,。
4,、加入完成后，96孔板要保持水平約30min使孔內的瓊脂糖凝固,。
三,、配置含Matrigel基質膠細胞懸液
1、取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞（或MCF-7細胞）,，胰蛋白酶(abs47014938)消化后進行細胞計數(shù),，用RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）將細胞懸液濃度調整至2.0×105cells/mL，備用,；
2,、將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內，將RPMI 1640培養(yǎng)基以及解凍的Matrigel基質膠從冰箱內取出置于冰上,。
注意：由于Matrigel基質膠在室溫下溶液凝固,，因此在操作過程中一定要保持低溫。
3,、將預冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺內,。根據(jù)計算量（2.5%，v/v）用移液器將300μL Matrigel基質膠加入到12mL RPMI 1640培養(yǎng)基內,，迅速混勻,。
注意：由于Matrigel基質膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預冷,。
4,、加入步驟1中的細胞懸液（約600μL），使細胞濃度為10000cells/mL,，迅速混勻,，備用；
四,、將細胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板
1,、將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質膠的細胞懸液放入加樣槽內，用多通道移液器吸取200μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內,；
2,、采用微孔板離心機(abs72035)進行離心，離心條件為4℃,，1000×g,，10min；
注意：離心96孔板時為保持無菌,，將96孔板的周圍用封口膜封住,。
3、離心完成后,，取出96孔板,，摘下封口膜，噴灑酒精后放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng),。整個培養(yǎng)流程如圖1所示,；
圖1
4、在培養(yǎng)的第3,、5和7天,，更換孔內的100μL培養(yǎng)基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態(tài)；
圖2
5,、若要采用3D多細胞腫瘤球進行藥物試驗,，在培養(yǎng)7天后，用移液器取出孔內的100μL培養(yǎng)基,，加入100μL給藥溶液,，然后置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長狀況（圖2）。
五,、3D多細胞腫瘤球的表征
1,、倒置顯微鏡觀察3D多細胞腫瘤球形態(tài)：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可；
2,、激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內的腫瘤球,，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定,，并用Hoechst 33258(abs47047617)對細胞核進行染色,，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖3）。
圖3
3,、環(huán)境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內的腫瘤球,，用PBS(abs962)清洗3遍后，固定干燥后進行環(huán)境掃描電鏡觀察（圖4）,。
圖4
常見問題：
在實踐中,，我們常常面臨細胞無法成球狀的問題。下面我們探討3D細胞培養(yǎng)中細胞不能成球狀的原因,，以及針對這些問題的解決方法,。
一,、細胞類型和特性：
細胞的類型和特性是影響其在3D環(huán)境中形成球狀結構的關鍵因素之一。不同類型的細胞具有不同的自組織和黏附性能,，可能更適合形成其他類型的3D結構,，如片狀、管狀等,。
解決方法：在進行3D培養(yǎng)實驗之前,，必須仔細選擇適合自組織的細胞類型。對于不易形成球狀結構的細胞,，可以嘗試使用誘導因子或基因調控方法來促進其自組織能力,。
二、細胞外基質 (ECM) 缺乏或不適當：
細胞成球狀通常需要適當?shù)募毎饣|支持,。如果培養(yǎng)基中的ECM成分不足或不適當,，細胞可能無法形成球狀。
解決方法：合理設計培養(yǎng)基中的ECM成分,，確保細胞有足夠的支持來形成球狀結構,。此外，可以考慮添加外源性ECM支持物質,，如適當?shù)?strong>基質蛋白,、生物活性的材料等。
三,、細胞密度不足：
細胞成球狀可能需要足夠的細胞密度來支持細胞間的相互作用和自組織,。如果細胞密度過低，可能會影響球狀結構的形成
解決方法：優(yōu)化細胞接種密度,，確保足夠的細胞數(shù)參與自組織過程,。
四、培養(yǎng)條件不適當：
培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基成分,、溫度,、氧氣濃度等可能會影響細胞成球狀的能力。不適當?shù)呐囵B(yǎng)條件可能阻礙了細胞的自組織能力,。
解決方法：通過優(yōu)化培養(yǎng)條件,，創(chuàng)造一個更有利于細胞自組織的環(huán)境，例如調整培養(yǎng)基成分,、溫度和氣體濃度,。
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