背景介紹:
羥脯氨酸(hydroxyproline,,HYP)是蛋白質(zhì)和多肽前體的重要組成部分,是一種游離氨基酸,在體內(nèi)沒有代謝途徑,,主要以原型經(jīng)尿排出,,其生理功能與賴氨酸類似,都是構(gòu)成氨基酸的一種重要成分,。羥脯氨酸在體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能,,與體內(nèi)許多重要的生理活動和病理變化密切相關(guān),在哺乳動物中,,它僅存在于膠原蛋白和彈性蛋白中,,但在植物中,許多蛋白質(zhì)都含有羥脯氨酸,。人體中含有大量羥脯氨酸,,它既是合成蛋白質(zhì)的原料,又是合成抗體和細(xì)胞因子等物質(zhì)的前體,,多種疾病如腫瘤,、炎癥等都會影響膠原蛋白更新,并可能導(dǎo)致血清或尿液羥脯氨酸升高,。
羥脯氨酸檢測在肺纖維化中的應(yīng)用:
各項研究指示,,膠原蛋白的過度沉積是纖維化疾病的主要特征,,而羥脯氨酸(HYP)作為膠原蛋白所有的一種氨基酸,,其含量約占膠原蛋白總氨基酸的13%,因此,,采用比色法,、 HPLC等生化方法測定組織中羥脯氨酸的總含量逐漸成為纖維化嚴(yán)重程度評價常用的方法學(xué),在2017年該方法學(xué)更是被美國胸科協(xié)會指南確立為肺纖維化臨床前評價的“金標(biāo)準(zhǔn)",。
2023年3月,,中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院陳永艷副教授團(tuán)隊在Immunity & Ageing期刊上發(fā)表了題為“UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fbrosis"的研究論文。本研究主要探討了老化的肺部容易受到慢性肺部疾病的影響,,發(fā)現(xiàn)老化的呼吸道上皮細(xì)胞顯著上調(diào)子宮球蛋白相關(guān)蛋白1(UGRP1)的表達(dá),,從而導(dǎo)致衰老肺中CCL6水平升高,而肺泡巨噬細(xì)胞(AM)隨著衰老而發(fā)生本質(zhì)變化,,表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量減少和基因表達(dá)改變,;UGRP1和MARCO+AM的上調(diào)參與了肺纖維化的進(jìn)展。因此UGRP1以CCL6依賴的方式調(diào)制與年齡相關(guān)的肺纖維化的MARCO+AM,,是為老齡化人群建立最佳靶向的關(guān)鍵,。
圖 運(yùn)用羥脯氨酸含量檢測試劑盒abs580066對肺組織進(jìn)行檢測
羥脯氨酸含量檢測試劑盒:
試劑盒組分 | 規(guī)格 | 儲存條件 |
96-Well Microplate | 1 plate | 常溫 |
Substrate | Powder x 1 | 4℃,避光保存 |
Substrate Diluent | 8 mL x 1 | 4℃,,避光保存 |
Stop Solution | 4 mL x 1 | 4℃ |
Dye Reagent | Powder x 1 | 4℃,,避光保存 |
Dye Reagent Diluent | 4 mL x 1 | 4℃ |
Standard | Powder x 1 | 4℃ |
Plate Adhesive Strips | 3 Strips | 常溫 |
另需自備的材料:酶標(biāo)儀(可讀取560nm處的吸光度)、蒸餾水、移液器與槍頭,、研缽,、離心機(jī)、高壓滅菌器,、6mol/L HCl,、10mol/L NaOH、酒精等,。
操作步驟(以組織樣本為例):
1,、樣本處理:稱取1g組織于玻璃管中,加入1mL 6mol/L HCl,,放入110℃烘箱中6~12h,,離心機(jī)16000g 25℃離心20min,取上清液至新離心管中 ,,然后加10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,。
2、試劑準(zhǔn)備:
1)Substrate:加入8mL Substrate Diluent溶解,。(現(xiàn)配現(xiàn)用)
2)Dye Reagent:加入4mL Dye Reagent Diluent溶解,。(現(xiàn)配現(xiàn)用)
3)標(biāo)準(zhǔn)品:加入1mL蒸餾水溶解Standard得到Standard①;從Standard①取10μL加入990μL蒸餾水中得到Standard②,;取200μL Standard②加入800μL蒸餾水中,,制備得到濃度為200μmol/L的Standard。
標(biāo)準(zhǔn)品二倍連續(xù)稀釋示例
3,、上樣:
1)分別將40uL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品加入相應(yīng)孔中,另設(shè)置空白孔加入40uL蒸餾水,;
2)每孔分別加入80uL Substrate,,混合均勻,室溫孵育20min,;
3)每孔分別加入40uL Stop Solution,,混合均勻,室溫孵育10min,;
4)每孔分別加入40uL Dye Reagent,,混合均勻,放入65℃烘箱中反應(yīng)20min,,冷卻至室溫,。
試劑 | 標(biāo)準(zhǔn)品孔 | 樣品孔 | 空白孔 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 40uL | -- | -- |
樣品 | -- | 40uL | -- |
蒸餾水 | -- | -- | 40uL |
Substrate | 80uL | 80uL | 80uL |
混合均勻,室溫孵育20min | |||
Stop Solution | 40uL | 40uL | 40uL |
混合均勻,,室溫孵育10min | |||
Dye Reagent | 40uL | 40uL | 40uL |
混合均勻,,放入65℃烘箱中反應(yīng)20min,,冷卻至室溫 |
4、檢測與計算:使用酶標(biāo)儀測量560nm處的吸光度,,擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣本濃度
注意事項:
1)對于未知的樣品,,建議多做幾個稀釋梯度進(jìn)行預(yù)實驗,確保讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),;
2)試劑盒中的試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用,,配好的溶液無法儲存,可能影響顯色讀數(shù)進(jìn)而影響檢測,;如果樣本需要分批檢測,,建議分批收樣儲存,待樣本收齊后統(tǒng)一檢測,;
3)每次實驗必須重新檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
Absin生化檢測試劑盒——氨基酸代謝系列:
貨號 | 品名 | 用途 |
abs580002 | Alanine Transaminase Microplate Assay Kit | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測 |
abs580004 | Aspartate Transaminase Microplate Assay Kit | 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測 |
abs580005 | Glutamate Microplate Assay Kit | 谷氨酸(Glu)檢測 |
abs580063 | Glutamate Synthase Microplate Assay Kit | 谷氨酸合成酶(GOGAT)檢測 |
abs580064 | Glutaminase Microplate Assay Kit | 谷氨酰胺酶(GLS)檢測 |
abs580066 | Hydroxyproline Microplate Assay Kit | 羥脯氨酸(HYP)檢測 |
abs580116 | Arginase Microplate Assay Kit | 精氨酸酶檢測 |
abs580184 | Lysine Microplate Assay Kit | 賴氨酸(LYS)檢測 |
abs580118 | Proline Microplate Assay Kit | 脯氨酸(PRO)檢測 |
abs580127 | Cysteine Microplate Assay Kit | 半胱氨酸(Cys)檢測 |
abs580187 | Total Amino Acid Microplate Assay Kit | 氨基酸(AA)檢測 |
abs580157 | Acetolactate Synthase Microplate Assay Kit | 乙酰乳酸合成酶/乙酰羥酸合酶(ALS)檢測 |
引用文獻(xiàn)
Chen Y, Hao X, Li M, Tian Z, Cheng M. UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fibrosis. Immun Ageing. 2023 Mar 18;20(1):14. doi: 10.1186/s12979-023-00338-8. PMID: 36934284; PMCID: PMC10024420.
好消息!Absin文獻(xiàn)獎勵重磅升級,!
Absin特色產(chǎn)品線:
WB相關(guān):ECL發(fā)光液,、預(yù)染marker、預(yù)制膠,;IHC相關(guān):二抗試劑盒,、組化筆;IP/CoIP試劑盒,;激動劑/抑制劑,;血清、BSA,、蛋白酶K,、CTB、TTX,、CEE;凋亡試劑盒,;呼吸爆發(fā)試劑盒,;ELISA試劑盒;重組蛋白,;抗體: 二抗,、標(biāo)簽抗體、對照抗體,;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
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