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外泌體概述：

外泌體是由活細(xì)胞分泌的,，包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì),，直徑在30-150nm的具有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，現(xiàn)在特指直徑40-100nm的盤狀囊泡,，主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體,，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。所有培養(yǎng)的細(xì)胞類型均可分泌外泌體,，且外泌體天然存在于體液中,，包括血液、唾液,、尿液,、腦脊液和乳汁等。

圖 外泌體示意圖

外泌體構(gòu)成：

外泌體富含膽固醇和鞘磷脂,，并攜帶有DNA,、mRNA、microRNA,、蛋白質(zhì),、脂質(zhì)以及一些代謝物，目前已經(jīng)通過286項研究發(fā)現(xiàn)了41860種蛋白質(zhì),、2838種microRNA,、3408種mRNA。

外泌體功能：

1）介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子轉(zhuǎn)移,。作為多重信號顆粒,，每個外泌體都有能力通過細(xì)胞表面同源受體的參與和聚集來傳遞多重組合信號，并且這種活性已被證明適用于參與生長因子,、細(xì)胞因子、Wnt和Notch途徑的蛋白質(zhì),。此外,，外泌體與靶細(xì)胞的融合具有將功能受體傳遞給靶細(xì)胞的能力，在某些情況下甚至激活受體和效應(yīng)物,；
2）人類的生殖,、懷孕和胚胎發(fā)育需要精確、精細(xì)和動態(tài)的細(xì)胞間通信,。母乳來源的外泌體具有調(diào)節(jié)胎兒免疫系統(tǒng)的功能,。在母乳中，外泌體不僅促進(jìn)產(chǎn)后胎兒健康和生長，母乳來源的外泌體含有具備免疫相關(guān)功能的miRNA,，并在體外增加外周血來源的T調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量,，可能調(diào)節(jié)免疫耐受；
3）調(diào)節(jié)免疫,。外泌體的供體細(xì)胞來源多種多樣,，如樹突狀細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞甚至免疫細(xì)胞本身,，且同一種細(xì)胞細(xì)胞在不同生理環(huán)境下分泌的外泌體功能不同,，可促進(jìn)免疫應(yīng)答，也可免疫抑制,；
4）外泌體與疾病,。外泌體可能在代謝性疾病的出現(xiàn)以及心血管健康中發(fā)揮作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們可以轉(zhuǎn)移代謝產(chǎn)物,，并通過小鼠和人類的胰腺b細(xì)胞,、脂肪組織、骨骼肌和肝臟之間的外泌體miRNA交換促進(jìn)細(xì)胞間通訊,；外泌體可以參與錯誤折疊蛋白質(zhì)的清除,，從而發(fā)揮解毒和神經(jīng)保護(hù)功能，進(jìn)而在退行性疾病中發(fā)揮作用,；與外泌體在其他疾病中的作用的研究相比,，外泌體對癌癥的研究進(jìn)展迅速，外泌體影響腫瘤形成,、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,、副腫瘤綜合征和對治療的耐藥性。

圖 外泌體與病毒感染

外泌體臨床應(yīng)用：

1）疾病診斷,。外泌體存在于所有生物液體中,，由所有細(xì)胞分泌，使其作為微創(chuàng)液體活檢具有吸引力,，并有可能進(jìn)行縱向采樣以跟蹤疾病進(jìn)展,。外泌體診斷應(yīng)用的焦點疾病包括心血管疾病、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的疾病和癌癥,；
2）載體制備,。與脂質(zhì)體相反，外泌體具有良好的耐受性,，在小鼠外源性給藥時可以以最小的免疫清除率遞送功能性藥物,；

3）治療作用。間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可以發(fā)揮治療作用,，并且在治療移植物抗宿主疾病患者中的應(yīng)用表明,，重復(fù)注射具有良好的耐受性,，不會產(chǎn)生顯著的副作用。

外泌體研究中的樣本制備：

圖 外泌體研究中的樣本類型

外泌體研究中的樣本涉及血液,、尿液,、乳汁、唾液,、腦脊液及細(xì)胞培養(yǎng)上清,，整體的原則是去除細(xì)胞、新鮮樣本,、低溫保存（-80℃）,。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外泌體提取和純化：

所需試劑：無外泌體胎牛血清（abs993）、細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒（abs50040）,、外泌體專用無血清培養(yǎng)基（abs9430）/外泌體專用無血清培養(yǎng)基（含生長因子）（abs9774）

圖 無外泌體胎牛血清 （abs993）

1）選取細(xì)胞狀態(tài)良好的代次,，在細(xì)胞匯合度達(dá)到60%左右時，更換為無血清培養(yǎng)基（abs9430）或者含無外泌體血清（abs993）的培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)48h后,，收集細(xì)胞上清液；
2）先用800~1000g左右的離心力10min有效去除細(xì)胞殘留,，取上清后,，再3000g離心10min有效去除細(xì)胞碎片物，去除細(xì)胞碎片的離心上清液轉(zhuǎn)移到新的50mL離心管中,；
3）在去除雜質(zhì)的離心上清液中加入Exosome Concentration Solution（ECS試劑）,，20mL上清液加入5mL ECS試劑；
4）加入ECS試劑后將離心管蓋緊,，通過渦旋振蕩器混勻1min,，再放置于 4℃靜置至少2h；（增加靜置時間可提高外泌體得率,，但靜置時間不可超過24h）
5）取出裝有混合液的離心管于4℃以10000g離心60min,，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒,；（注：盡可能吸凈上清液）
6）外泌體重懸：取1×PBS均勻吹打離心沉淀物（具體加入劑量如下表）,，待其溶解后，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的5mL離心管中,；
7）將含有重懸液的5mL離心管于4℃以12000g離心2min,，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒,；（注：若沉淀較多，可12000g/2min 離心多次至無明顯沉淀,，每次取離心上清液）
8）純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入Exosome Purification Filter（EPF柱）上室中,，于 4℃以3000g離心10min,，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒,；（注：EPF柱不可重復(fù)使用）

9）外泌體的保存： 純化后的外泌體以50-100μL進(jìn)行分裝保存于-80℃低溫冰箱中,，以備后繼實驗使用，外泌體保存液（2×）（abs9776）,，能夠?qū)⑼饷隗w在4℃條件下保存至少6個月,，適用于液態(tài)及凍干形態(tài)，能夠有效降低凍干對外泌體的負(fù)面影響,。

注意事項：

1）在收獲細(xì)胞時,，盡量保證死細(xì)胞數(shù)量不超過5%，因為凋亡,、死亡的細(xì)胞會分泌凋亡小體,，從而對活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體造成污染；
2）如果后期要將提取的外泌體進(jìn)行共孵育或者動物實驗,，需要用2um的濾器對外泌體進(jìn)行除菌,；
3）細(xì)胞上清樣品越早處理越好，長時間放置,，含有的細(xì)胞破裂,，胞內(nèi)囊泡釋放也會對活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體產(chǎn)生污染；
4）不能用DMEM,、1640,、F12 這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基替代血清或者外泌體專用無血清培養(yǎng)基呢，細(xì)胞在這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的環(huán)境下,，是處于饑餓狀態(tài)的,，細(xì)胞會將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)全部消耗掉的，這時的上清液中的外泌體含量會大幅度下降,。

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[1] Pegtel D M, Gould S J. Exosomes[J]. Annual review of biochemistry, 2019, 88: 487-514.
[2] Kalluri R, LeBleu V S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science, 2020, 367(6478): eaau6977.

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