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NK細(xì)胞概述：

自然殺傷（nature killer，NK）細(xì)胞屬于天然淋巴樣細(xì)胞家族,，在人類(lèi)中通常被定義為CD3^- CD56⁺細(xì)胞,，占循環(huán)淋巴細(xì)胞的5%～15%。NK細(xì)胞是抵御病毒感染和細(xì)胞突變的第一道防線,，無(wú)需預(yù)先致敏就能殺死威脅宿主的癌細(xì)胞、異體細(xì)胞和外來(lái)病原體感染的細(xì)胞,，被認(rèn)為是癌癥免疫監(jiān)測(cè),、移植排斥和早期病毒免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。

圖 NK細(xì)胞（黃）和癌細(xì)胞（紅）

NK細(xì)胞免疫療法：

CAT免疫療法的成功激發(fā)了研究者們利用其他免疫細(xì)胞進(jìn)行癌癥治療的興趣,，簡(jiǎn)單的說(shuō)細(xì)胞免疫療法就是采集人體自身免疫細(xì)胞,，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，使其數(shù)量倍增,，然后再回輸?shù)饺梭w,，一方面用來(lái)消除癌細(xì)胞、突變細(xì)胞,，另一方面激活和增強(qiáng)機(jī)體免疫力,，控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。與CAT-T療法相比,，NK療法可以靶向多種致病性抗原,，具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且不分泌引發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的主要細(xì)胞因子,，可以極大地減輕不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),，被寄予厚望。

NK細(xì)胞治療的主要策略：

體外活化的自體或異體NK細(xì)胞,、NK細(xì)胞和單抗藥（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）聯(lián)合來(lái)誘導(dǎo)抗體特異的細(xì)胞毒性（如：抗EGFR的西妥昔單抗）,、CAR-NK細(xì)胞免疫療法等等。

目前尚未有NK細(xì)胞療法上市，但其臨床試驗(yàn)如火如荼,，截止11月份clinicaltrials網(wǎng)站上,，關(guān)于“NK Cell"的搜索結(jié)果已高達(dá)720例，目前在NK細(xì)胞療法在已經(jīng)在急性髓細(xì)胞白血病,、慢性髓性白血病,、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)母細(xì)胞瘤,、以及胃癌,、肝癌、肺癌,、腸癌等實(shí)體瘤的治療中表現(xiàn)出良好的治療效果,。

圖 clinicaltrials中“NK Cell"的搜索結(jié)果

體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞來(lái)源：

NK細(xì)胞除了從自體或異體的外周血分離獲得，還可以來(lái)源于臍帶血,、干細(xì)胞分化等,，此外，由于以上三種方式獲得細(xì)胞的繁瑣,，在CAT-NK的研究中,，不少研究者使用NK-92進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，臨床前研究已經(jīng)取得了較好結(jié)果,，值得注意的是,，需要在輸注前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行輻射。

人外周血NK細(xì)胞的分離純化方案：

準(zhǔn)備：15mL離心管（abs7102）或錐形管,、Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）,、人淋巴細(xì)胞分離液（abs930）。

圖 愛(ài)必信人淋巴細(xì)胞分離液（abs930）

1,、獲取PBMC

1）準(zhǔn)備無(wú)菌的15mL離心管或錐形管,；
2）加入淋巴細(xì)胞分離液5mL；（注意：淋巴細(xì)胞分離液使用前需恢復(fù)室溫,，18-25℃）
3）Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）緩沖液1:1比例（如果全血樣本粘稠,，可適當(dāng)增大比例）稀釋抗凝過(guò)的全血樣品；
4）小心沿著壁管,，接近分離液層面,，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過(guò)的4mL全血樣品在淋巴細(xì)胞分離液上面；（注意：切記不要攪渾淋巴細(xì)胞分離液）
5）小心放進(jìn)離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子）,，4℃離心20-30min,，速度為400g-1000g；（注意：離心機(jī)剎車(chē)應(yīng)取消,，需等待自然停止）
6）小心取出離管,，切記不要震動(dòng),；
7）可見(jiàn)上層為淡紅色透明血漿，其次為薄薄的致密白色環(huán),，為PBMC,；
8）吸棄上清后，將白膜層輕輕地吸出來(lái)轉(zhuǎn)移到新的離心管中,；
9）用PBS重懸,，室溫，300g離心10min,，重復(fù)操作2次,，棄去上清，用少量PBS重懸,。

2,、NK細(xì)胞的純化

NK細(xì)胞純化常用的方式是磁珠分選，包括陽(yáng)性分選和陰性分選兩種,，人NK細(xì)胞發(fā)育階段主要基于CD34,、CD117、CD56和CD94的表達(dá)水平,。CD56表達(dá)增加是NK成熟的關(guān)鍵,，CD56+和CD16+可以鑒別和分離不受其他淋巴細(xì)胞污染的NK細(xì)胞。此外,，白細(xì)胞介素2/15受體β（CD122）也是NK細(xì)胞發(fā)育后期的重要標(biāo)志,。

3、NK細(xì)胞培養(yǎng)

1）將純化后的NK細(xì)胞用免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（abs9772）重懸,，按照一定密度接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。

2）在免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中添加100-200IU/mL的IL-2,，確保NK細(xì)胞的增值和活化并有助于提高細(xì)胞毒性,，與IL-15聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，有利于NK細(xì)胞的激活,。 

3）將細(xì)胞置于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)至少48h,，再進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能鑒定等實(shí)驗(yàn)。

名詞通解：

陽(yáng)性篩選：磁珠結(jié)合需要篩選細(xì)胞的表面標(biāo)志物,，達(dá)到純化目的,。

陰形篩選：通過(guò)磁珠結(jié)合等手段除去混合物細(xì)胞中除目的細(xì)胞之外的其他細(xì)胞，以達(dá)到純化目的,。

關(guān)于NK細(xì)胞的講解就到這里啦,！有疑問(wèn)的小伙伴歡迎公眾號(hào)“愛(ài)必信生物"后臺(tái)咨詢(xún)！

本期小愛(ài)產(chǎn)品推薦

[1] 米錦濤;袁成良.NK細(xì)胞相關(guān)免疫檢查點(diǎn)及其抑制劑的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2023,31(24):4645-4650.
[2] Shimasaki N, Jain A, Campana D. NK cells for cancer immunotherapy[J]. Nature reviews Drug discovery, 2020, 19(3): 200-218.

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