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很多老師咨詢類器官RNA和蛋白如何提取,，其實類器官可以按微小組織進行RNA和蛋白提取，今天小愛給大家講一講提取方法,。

類器官蛋白提取方法

一,、試劑準備（細胞漿、細胞核及細胞膜蛋白抽提試劑盒(abs9346)）

1,、準備溶液

1）室溫融解試劑盒中的各種溶液,，溶解后除結(jié)構(gòu)蛋白提取液外，其他試劑立即置于冰上,；

2）結(jié)構(gòu)蛋白提取液溶解后,，可放置于37℃水浴中溫浴至透明后，常溫放置,。

2,、蛋白提取工作液的準備

1）胞漿蛋白提取工作液的準備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時胞漿蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF,；

2）胞核蛋白提取工作液的準備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時胞核蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF,；

3）膜蛋白提取工作液的準備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時膜蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF,；

4）結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液的制備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時結(jié)構(gòu)蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF,。

二、類器官收集及洗滌

1,、類器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5孔為一組），4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化）,，300g ,，4℃， 離心5min棄上清,。

2,、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸，300g ，4℃,，離心5min棄上清,。

三、類器官蛋白提取

1,、胞漿蛋白提取

1）向含類器官沉淀的EP中加入2mL的胞漿蛋白提取工作液,，在4℃條件下震蕩20min；

2）準備1-5mL的注射器,，用注射器吹打步驟1震蕩過的溶液50-90次,，在4℃條件下，15000g離心10min,。取上清液存于EP管中,，即為胞漿蛋白。

2,、胞核蛋白的提取

取3.1.2步驟獲得的沉淀物加入4mL冰浴的胞漿蛋白提取工作液,，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min,，棄去上清液,，沉淀物中加入1mL冰凍的胞核蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min,，4℃條件下15000g離心10min,，上清液為細胞核蛋白，轉(zhuǎn)入EP管并保存,。

3,、胞膜蛋白的提取

在步驟3.2中的沉淀物中加入1mL冰凍的膜蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min,，4℃條件下15000g離心10min,，上清液為細胞膜蛋白，轉(zhuǎn)入EP管并保存,。

4,、結(jié)構(gòu)蛋白的提取

在步驟3.3的沉淀物中加入常溫或37℃水浴過的透明的結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液0.5mL，4℃條件下震蕩5min,，4℃條件下15000g離心10min,，保存上清液即為細胞骨架蛋白。

5,、待測蛋白的保存待檢測濃度的蛋白存于-70℃,，可以用于Western，EMSA,，footprinting,，報告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作,。

類器官RNA提取方法

一、類器官收集及洗滌

1,、類器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）,，4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化）,，300g ，4℃,， 離心5min棄上清,。

2、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸,，轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管,，300g ，4℃,，離心5min棄上清,。

二、類器官RNA提?。ǔ兛俁NA快速提取試劑盒(含DNase I),，貨號abs60026）

1、向含類器官沉淀的EP中加入1mL的RL（試劑盒組分）溶解細胞,，并用移液槍輕輕吹打混勻,，使RL充分和類器官接觸裂解細胞并滅活RNA酶；
2,、將勻漿樣品劇烈震蕩混勻,，在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體分解；
3,、每1mL RL加0.2mL氯仿,。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15sec并將其在室溫下孵育3min,；
4,、于4℃，12000 rpm離心10min,，樣品會分成三層：下層有機相,，中間層和上層無色的水相，RNA存在于水相中,。水相層的容量大約為所加RL體積的60%,，把水相轉(zhuǎn)移到新管中,，進行下一步操作；
5,、加入1倍體積70％乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,，顛倒混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管內(nèi)）,；
6,、12000 rpm 離心45sec，棄廢液,，將吸附柱重新套回收集管,；
7、加400μL去蛋白液RE,，12000 rpm 離心45sec,，棄廢液；
8,、DNase I工作液的配制：取10μL DNase I儲存液放入新的RNase-free離心管中,，加入70μL RDD溶液，輕柔混勻,；
9,、向吸附柱RA中央加入80μL DNase I工作液，室溫放置15min（一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果,，如果室溫效果不佳可選擇在37℃放置15min）,；
10、加400μL去蛋白液RE,，12000 rpm 離心45sec,，棄掉廢液；
11,、加入500μL漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇?。?2000 rpm離心45sec,， 棄掉廢液,；
12、加入500μL漂洗液RW,，12000 rpm 離心45sec,，棄掉廢液；
13,、將吸附柱RA放回空收集管中,，12000 rpm離心2min，盡量除去漂洗液,，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng),；
14,、取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中,，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量往吸附膜的中間部位加50-80μL RNase free H₂O（事先在 65℃水浴中加熱效果更好）,，室溫放置2min，12000 rpm 離心1min,，所得溶液即為RNA溶液,。如果需要較多RNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,，離心1min,。

提取得到的RNA溶液，可以直接應(yīng)用于Northern 雜交,、RT-PCR、Real Time RT-PCR,、cDNA文庫構(gòu)建,、體外翻譯等各種常規(guī)分子生物學(xué)實驗。

今天講解就到這了,，大家如有實驗問題,，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺交流哦！

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