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很多老師咨詢類器官RNA和蛋白如何提取,，其實類器官可以按微小組織進行RNA和蛋白提取,，今天小愛給大家講一講提取方法。

類器官蛋白提取方法

一,、試劑準備（細胞漿,、細胞核及細胞膜蛋白抽提試劑盒(abs9346)）

1、準備溶液

1）室溫融解試劑盒中的各種溶液，溶解后除結構蛋白提取液外,，其他試劑立即置于冰上,；

2）結構蛋白提取液溶解后，可放置于37℃水浴中溫浴至透明后,，常溫放置,。

2、蛋白提取工作液的準備

1）胞漿蛋白提取工作液的準備：臨用前,，根據處理樣品的量估算實驗時胞漿蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

2）胞核蛋白提取工作液的準備：臨用前,，根據處理樣品的量估算實驗時胞核蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

3）膜蛋白提取工作液的準備：臨用前,，根據處理樣品的量估算實驗時膜蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

4）結構蛋白提取工作液的制備：臨用前,，根據處理樣品的量估算實驗時結構蛋白提取液的需要量,，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。

二,、類器官收集及洗滌

1,、類器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730),，輕柔吹打基質膠,，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）,，4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化）,，300g ，4℃,， 離心5min棄上清,。

2、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸,，300g ,，4℃，離心5min棄上清,。

三,、類器官蛋白提取

1、胞漿蛋白提取

1）向含類器官沉淀的EP中加入2mL的胞漿蛋白提取工作液,，在4℃條件下震蕩20min,；

2）準備1-5mL的注射器,，用注射器吹打步驟1震蕩過的溶液50-90次，在4℃條件下,，15000g離心10min,。取上清液存于EP管中,，即為胞漿蛋白,。

2、胞核蛋白的提取

取3.1.2步驟獲得的沉淀物加入4mL冰浴的胞漿蛋白提取工作液,，在4℃條件下震蕩5min,，4℃條件下15000g離心10min，棄去上清液,，沉淀物中加入1mL冰凍的胞核蛋白提取工作液,，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min,，上清液為細胞核蛋白,，轉入EP管并保存。

3,、胞膜蛋白的提取

在步驟3.2中的沉淀物中加入1mL冰凍的膜蛋白提取工作液,，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min,，上清液為細胞膜蛋白,，轉入EP管并保存。

4,、結構蛋白的提取

在步驟3.3的沉淀物中加入常溫或37℃水浴過的透明的結構蛋白提取工作液0.5mL,，4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min,，保存上清液即為細胞骨架蛋白,。

5、待測蛋白的保存待檢測濃度的蛋白存于-70℃,，可以用于Western,，EMSA，footprinting,，報告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作,。

類器官RNA提取方法

一、類器官收集及洗滌

1,、類器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質膠,，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5孔為一組）,，4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化），300g ,，4℃,， 離心5min棄上清。

2,、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸,，轉移到1.5mL EP管，300g ,，4℃,，離心5min棄上清。

二,、類器官RNA提?。ǔ兛俁NA快速提取試劑盒(含DNase I)，貨號abs60026）

1,、向含類器官沉淀的EP中加入1mL的RL（試劑盒組分）溶解細胞,，并用移液槍輕輕吹打混勻，使RL充分和類器官接觸裂解細胞并滅活RNA酶,；
2,、將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體分解,；
3,、每1mL RL加0.2mL氯仿。蓋緊樣品管蓋,，劇烈振蕩15sec并將其在室溫下孵育3min,；
4、于4℃,，12000 rpm離心10min,，樣品會分成三層：下層有機相，中間層和上層無色的水相,，RNA存在于水相中,。水相層的容量大約為所加RL體積的60%，把水相轉移到新管中,，進行下一步操作,；
5、加入1倍體積70％乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,，顛倒混勻（此時可能會出現沉淀）,。得到的溶液和可能沉淀一起轉入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管內）；
6,、12000 rpm 離心45sec,，棄廢液,，將吸附柱重新套回收集管；
7,、加400μL去蛋白液RE,，12000 rpm 離心45sec，棄廢液,；
8,、DNase I工作液的配制：取10μL DNase I儲存液放入新的RNase-free離心管中，加入70μL RDD溶液,，輕柔混勻,；
9,、向吸附柱RA中央加入80μL DNase I工作液,，室溫放置15min（一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果，如果室溫效果不佳可選擇在37℃放置15min）,；
10,、加400μL去蛋白液RE，12000 rpm 離心45sec,，棄掉廢液,；
11、加入500μL漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇?。?，12000 rpm離心45sec， 棄掉廢液,；
12,、加入500μL漂洗液RW，12000 rpm 離心45sec,，棄掉廢液,；
13、將吸附柱RA放回空收集管中,，12000 rpm離心2min,，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應,；
14,、取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中,，根據預期RNA產量往吸附膜的中間部位加50-80μL RNase free H₂O（事先在 65℃水浴中加熱效果更好）,，室溫放置2min，12000 rpm 離心1min,，所得溶液即為RNA溶液,。如果需要較多RNA,，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1min,。

提取得到的RNA溶液,，可以直接應用于Northern 雜交、RT-PCR,、Real Time RT-PCR,、cDNA文庫構建、體外翻譯等各種常規(guī)分子生物學實驗,。

今天講解就到這了,，大家如有實驗問題，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺交流哦,！

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