外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,，PBMC）是外周血（即除骨髓以外的血液）中具有單個(gè)核的細(xì)胞的混合細(xì)胞群體,，包括自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell,，NK）、T淋巴細(xì)胞（70%-90%）,、B淋巴細(xì)胞,。能夠進(jìn)一步分離純化，是免疫細(xì)胞的主要來(lái)源,。
表1 PBMC組分及占比
組分 | 占比 |
單核細(xì)胞 | 10-30% |
淋巴細(xì)胞 | 70-90% |
T淋巴細(xì)胞（CD3+) | 45-70% |
CD4+T淋巴細(xì)胞 | CD3+T淋巴細(xì)胞的25-60% |
CD8+T淋巴細(xì)胞 | CD3+T淋巴細(xì)胞的5-30% |
B淋巴細(xì)胞 | 5-15% |
自然殺傷細(xì)胞 | 5-10% |
樹突狀細(xì)胞 | 1-2% |
干細(xì)胞 | 0.1-0.2% |
單核細(xì)胞（monocyte）是血液中最大的白細(xì)胞,，來(lái)源于骨髓中的造血干細(xì)胞，并在骨髓中發(fā)育,，當(dāng)它們從骨髓進(jìn)入血液時(shí)仍然是尚未成熟的細(xì)胞,，與各種細(xì)胞因子一起培養(yǎng)，可定向分化為巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等,。注意不要把單個(gè)核細(xì)胞和單核細(xì)胞兩者的概念混淆,。
圖1 單核細(xì)胞（左）和淋巴細(xì)胞（右）
PBMC是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，作為免疫學(xué),、惡性腫瘤,、疫苗研發(fā)、移植治療等方向最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)原料被廣泛使用,。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞成為了免疫細(xì)胞研究的基礎(chǔ),，外周血單個(gè)核細(xì)胞比重為1.070左右，而紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過(guò)1.080,。這樣利用介于兩者比重之間的溶液做密度梯度離心,，就可得到單個(gè)核細(xì)胞。常用的是聚蔗糖和泛影酸鈉混合比重為1.070±0.001的溶液,，國(guó)內(nèi)常用泛影葡胺代替泛影酸鈉,。
圖2 PBMC分離提取示意圖
PBMC分離提取操作步驟：
1）用無(wú)菌稀釋液將血樣稀釋2-4倍；
2）在50ml錐底離心管中先加入15-20ml分離液,，然后緩慢加入20-30ml經(jīng)稀釋的全血或組織細(xì)胞懸液至分離液液面之上,。（適當(dāng)增加分離液的使用量，將有利于提高單個(gè)核細(xì)胞純度）,；
3）室溫400g離心15-30min,，保證轉(zhuǎn)子速度平穩(wěn)下降；
4）將離心管小心地從離心機(jī)中取出,，緩緩地吸去最上層,，避免接觸單個(gè)核細(xì)胞層；
5）將單個(gè)核細(xì)胞層緩慢轉(zhuǎn)移到另一支50ml錐底離心管中,；
6）加入無(wú)菌洗滌液并混勻后,，室溫下300g離心10min，小心棄掉上清,；
7）為了去除殘余血小板,，可將細(xì)胞重懸于30-50ml無(wú)菌洗滌液中,，室溫200g離心10-15min，小心棄掉上清,；
8）可選擇地重復(fù)第7步,，將會(huì)去除絕大部分血小板；
9）將細(xì)胞用緩沖液或培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行檢測(cè),、培養(yǎng)等后續(xù)操作,。
此法操作得當(dāng)，單個(gè)核細(xì)胞得率可達(dá)80%-90%,，影響得率最重要的因素是分層液的比重,。
圖3 分離培養(yǎng)的PBMC
PBMC激活：
PBMC一般需要加細(xì)胞因子刺激，否則很快就會(huì)凋亡,。推薦使用包被法,。
1）六孔板 5μg/mL CD3 800μL（室溫2h 或 4℃過(guò)夜）；
2）加入 RPMI-1640培養(yǎng)基(abs9484)+優(yōu)級(jí)胎牛血清(abs972)+1μg/mL CD28+100IU/mL IL-2,，細(xì)胞密度建議1-2×106/ml, 刺激2-3d,；
細(xì)胞因子濃度、種類及細(xì)胞數(shù)量可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整,。
PBMC凍存：
10% DMSO(abs9187)+FBS(abs972)
1）制備含20%DMSO的FBS溶液,，置于冰上。（100%DMSO在冰上會(huì)形成冰晶）;
2）確保PBMC為單細(xì)胞懸液,。300×g離心10min,，棄上清；
3）按1-20×106cells/mL的濃度將PBMC重懸于預(yù)冷的FBS中,；
4）按1:1的比例將細(xì)胞和含20%DMSO的FBS混合,。快速將1mL的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到凍存管,；
5）將凍存管立即放入梯度降溫盒中,，在-80℃的冰箱中放置過(guò)夜后立即轉(zhuǎn)入液氮。
PBMC離體之后越快冷凍越能保證其活性及功能,。當(dāng)全血離體一段時(shí)間后,，再使用Ficoll進(jìn)行分離，中性粒細(xì)胞會(huì)被活化,，從而嚴(yán)重影響密度梯度離心得到PBMC的效率,，從靜置24h后的模擬運(yùn)輸環(huán)境中分離得到的PBMC，其組分中T細(xì)胞和NK細(xì)胞含量會(huì)發(fā)生明顯變化,，對(duì)刺激的反應(yīng)也會(huì)弱化。
今天的文章就到這里啦,，PBMC還有很多相關(guān)實(shí)驗(yàn),，歡迎大家公主號(hào)“愛必信生物"后臺(tái)留言,，一起探討更多細(xì)胞培養(yǎng)問題。
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abs9484 | RPMI 1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺,，不含HEPES） | 500mL |
abs9275 | RPMI 1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺,，不含HEPES，不含酚紅） | 500mL |
abs930 | 淋巴細(xì)胞分離液 | 200mL |
abs9518 | 大小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液 | 100mL |
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abs9101 | 紅細(xì)胞裂解液,，1× | 100mL |
abs9187 | 二甲基亞砜(DMSO)(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)) | 50mL |
* 注：文中圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò),，僅供學(xué)習(xí)參考用
參考文獻(xiàn)
Gebauer B S, Hricik D E, Atallah A, et al. Evolution of the enzyme‐linked immunosorbent spot assay for post‐transplant alloreactivity as a potentially useful immune monitoring tool[J]. American journal of transplantation, 2002, 2(9): 857-866.
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