一,、免疫熒光的原理
免疫熒光(Immunofluorescence，IF)技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,，制成熒光抗體再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位,，以及利用定量技術(shù)測定含量,。
二、IF分類
中文全稱 | 縮寫 | 中文全程 | 實(shí)驗(yàn)樣本 |
細(xì)胞免疫熒光 | IF-IC | 細(xì)胞免疫熒光 | 懸浮或貼壁細(xì)胞 |
組織免疫熒光 | IF-F | 冰凍切片免疫熒光 | 冰凍組織,，抗原保存更加,，但要避免出現(xiàn)冰晶 |
IF-P | 石蠟切片免疫熒光 | 石蠟包埋的細(xì)胞團(tuán)或組織，易儲(chǔ)存,，形態(tài)佳 |
三,、IF實(shí)驗(yàn)流程
1）樣品準(zhǔn)備：對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí),，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞,，取對數(shù)生長細(xì)胞,，用PBS離心洗滌 (1000rpm、5min) 2次,，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,；
2）固定：4%多聚甲醛(PFA)溶液固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3遍,，每次5min,；
3）通透：0.5% TritonX100，通透15-20min,，PBS洗滌3遍,，每次5min；
4）封閉：3%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉30min-1h ,，封閉的作用是可以減少一抗和二抗與非靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行非特異性結(jié)合時(shí)所產(chǎn)生的本底信號,；
5）抗孵育：封閉過后，不用洗,，直接將多余的BSA吸走,，用稀釋后的一抗（用3% BSA稀釋）4度過夜孵育;
6）二抗孵育：PBST洗滌3遍，每次5min,，洗去未結(jié)合的抗體,。而后用稀釋后的二抗（用3% BSA稀釋）室溫避光孵育1h，PBST洗滌3遍,，每次5min,；
7）細(xì)胞核染色：滴加DAPI避光染色5min，PBS洗滌3遍,，每次5min（染細(xì)胞核是為了定位細(xì)胞）,；
8）拍照：立即用激光共聚焦或熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，如果需要等待,，則避光放在4°保存,。
四、檢測方法
檢測方法分為直接檢驗(yàn)和間接檢驗(yàn),，我們一般多采用間接檢驗(yàn)（一抗+二抗）的方式,。
抗原檢測 | 熒光素偶聯(lián)一抗 | 熒光素偶聯(lián)二抗 | 二抗處聯(lián)HRP，酪氨信號放大系統(tǒng) |
優(yōu)點(diǎn) | 操作簡便,，一步法,，多染信號強(qiáng)度中等時(shí)不受抗體來源限制 | 信號強(qiáng)度中等 | 信號強(qiáng)，多染時(shí)不受抗體來源限制 |
缺點(diǎn) | 信號強(qiáng)度低 | 兩步法,，背景可能變高 | 需要摸索條件,，可能帶來背景或非特異染色 |
五,、免疫熒光雙染
在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測兩種抗原時(shí)，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧p重免應(yīng)焚光標(biāo)記法也分為直接法和間接法,。
1）直接法：將兩種不同熒光素偶聯(lián)的抗體（如抗A和抗B）以適當(dāng)比例混合,，樣本孵育，潤洗,，封片,，鏡檢；
特點(diǎn)：簡便可靠,，不需要考慮一抗種屬來源的問題,，但靈敏度較低。
2）間接法：用未標(biāo)記的兩種一抗薄育樣本,，潤洗后,，加入兩種不同的熒光素偶聯(lián)的對應(yīng)二抗辯育樣本，潤洗,，封片,，鏡檢；
3）特點(diǎn)：使用此法應(yīng)注意兩種特異性一抗必須來源于不同種屬,，且熒光標(biāo)記二抗,、一抗的種屬要相匹配。
六,、IF注意事項(xiàng)
1）固定時(shí)間影響熒光固定效果,，針對細(xì)胞樣品，如果用4%多聚甲醛固定,，推薦固定時(shí)長15min,，時(shí)間太短沒有達(dá)到固定效果時(shí)間太長會(huì)導(dǎo)致甲醛被氧化成甲酸，沒有固定作用了,；
2）保持醛固定液新鮮,，否則自發(fā)熒光背景會(huì)升高；
3）使用抗體時(shí),，需要查詢說明書,。因?yàn)椴煌贵w使用場景不一樣，確認(rèn)抗體是否能用于細(xì)胞IF,、冰凍切片IF,、 石蠟切片IF,；
4）細(xì)胞密度是整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵點(diǎn)之一,。如果細(xì)胞數(shù)量太多，產(chǎn)生疊加,，也會(huì)影響整體熒光效果,；
5）洗滌過程輕柔,，防止加液過程沖力過大丟失細(xì)胞；
6）通透時(shí)間一般為15-20min,，過短過長效果均不好,，應(yīng)做不同時(shí)間梯度摸索。
七,、IF常見問題總結(jié)
1）信號微弱或沒有信號
可能原因 | 解決方法 |
目的蛋白需要誘導(dǎo)表達(dá)或者表達(dá)量低 | 對于需要誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白,，參考文獻(xiàn)找到誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的最佳處理?xiàng)l件和陽性對照；表達(dá)量低的蛋白考慮信號擴(kuò)增,，或與更亮的熒光基團(tuán)配對,；在可能的情況下，應(yīng)使用蛋白印跡法或其他方法來確認(rèn)蛋白表達(dá)情況 |
樣本保存不當(dāng),。如熒光基團(tuán)在光線下 暴露時(shí)間過長,，可能會(huì)導(dǎo)致信號衰減 | 在避光條件下進(jìn)行孵育和保存樣本?？稍诜来銣绲娜芤褐蟹夤虡颖?。樣本封固后要立即采集圖像，以獲取最佳結(jié)果 |
細(xì)胞/組織樣本保存時(shí)間過長 | 使用新制備的樣本載玻片/板 |
固定不足 | 請參考產(chǎn)品說明書,；處理后立即移除介質(zhì)并在固定劑中快速清洗對于磷酸化特異的抗體,，使用濃度為至少4%的甲醛來抑制內(nèi)源性磷酸酶 |
抗體用量不合適 | 參見說明書建議的抗體稀釋濃度，并根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索 |
一抗孵育時(shí)間不合適 | 建議在4"C過夜孵育以獲得最佳結(jié)果 |
錯(cuò)誤的通透方法 | 參見產(chǎn)品說明書中建議的提作步驟 |
二抗使用不當(dāng) | 按建議濃度使用,，檢查二抗是否與一抗的宿主物種相匹配 |
錯(cuò)誤的激發(fā)波長 | 確保激發(fā)和檢測(激光/激發(fā)/發(fā)射濾光器)與熒光基團(tuán)激發(fā)光波長相匹配 |
2）高背景
原因 | 解決方法 |
封閉不充分 | 使用與二抗相同物種的正常血清,，封閉1h |
抗體使用濃度過高 | 參考說明書推薦濃度，并根據(jù)蛋白表達(dá)量進(jìn)行優(yōu)化 |
抗體育時(shí)間過長或孵育溫度過高 | 參考說明書推薦的孵育時(shí)間和溫度 |
樣本變干 | 染色過程中,，確保樣本始終漫沒在液體中 |
清洗不足 | 清洗以移除多余固定劑,、多余二抗，以及結(jié)合松散,、非特異性的抗體相互作用 |
樣本自發(fā)熒光 | 以未染色樣本為對照,，檢測自發(fā)熒光程度。參考說明書推薦的固定劑,，用久了的固定劑可能會(huì)出現(xiàn)自發(fā)熒光,。更換陳舊甲醛、制備新鮮的稀釋液,。使用在安瓶中新稀釋的,、可用于電子顯微鏡（EM級）的戊二醛。為低豐度靶標(biāo)選擇較長的波長通道 |
非特異性抗體結(jié)合 | 如可能,，請與敲低(siRNA)或除細(xì)胞,，或與已知靶抗原表達(dá)水平較高或較低的細(xì)胞進(jìn)行比較 |
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