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我們辛辛苦苦養(yǎng)好的類器官，該如何做鑒定呢,？通常是HE染色,、免疫組化或免疫熒光。今天小愛帶大家了解一下具體的染色步驟,。

一,、HE染色實(shí)驗(yàn)步驟

1、類器官收集

1）類器官收集（例如24孔板,，收集6-8孔類器官,，大約1000-2000個(gè)類器官）

移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml左右,，移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min,。300g 4℃離心5min棄去上清,。

2）類器官清洗

加入1ml PBS重懸移入1.5ml離心管，300g 4℃離心5min棄去液體,。

2,、類器官固定

1）PFA固定

加入1ml 4%多聚甲醛（abs9179）至EP管，輕柔吹打混勻,，至于4℃固定1h（最長不超過10h）,。固定結(jié)束后，300g 4℃離心5min棄去上清,。

2）類器官清洗

加入1ml PBS重懸移入1.5ml離心管,，300g 4℃離心5min棄去液體,。

3、類器官瓊脂糖包埋

1）稱量0.2至0.4g瓊脂糖,，加入至燒杯或者小試劑瓶內(nèi)，加入10ml左右PBS,。微波爐高火融化,，每隔5s暫停打開，觀察,，重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化,。

2）待瓊脂糖溶液降溫至50-60℃，取20-50ul融化瓊脂糖溶液,，加入至1.5ml EP管重懸類器官沉淀,，冰上放30min，待其凝固,。

4,、類器官石蠟包埋

1）脫水：取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊，在梯度乙醇中脫水,，70%,、80%、90%和95%乙醇各1h,，100%乙醇30min,，待其凝固；

2）融蠟：提前4h左右打開烘箱,，65℃溶蠟,；

3）透明：將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中（二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中），將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次,；
注：因二甲苯有毒性,，需在通風(fēng)良好區(qū)域進(jìn)行操作，取出時(shí)盡量瀝盡殘留二甲苯,。

4）浸蠟：透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中,，60℃浸蠟2h后，更換新的蠟缸再次浸蠟2h,；

5）包埋：包埋在冰盒上進(jìn)行,，將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處，將瓊脂塊放置于中間位置,，然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M,。待蠟塊凝固后，小心脫下模具,。

6）切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上,，切成薄片,，一般是5-8um厚，并用小鑷子將包含有完整組織的切片置于40°C溫水中,；
7）撈組織：組織受熱展開,，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí),，一般取載玻片的下1/3或者下1/2,，一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的,，每張載玻片上通常撈兩份組織,，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了,，而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致,，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上,，放入37°C溫箱中烘干,。

5、類器官HE染色

1）脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 10min,；二甲苯Ⅱ10min,；無水乙醇Ⅰ5min；無水乙醇Ⅱ5min,；95%酒精5min,；90%酒精5min；80%酒精5min,；70%酒精5min,；蒸餾水洗；

2）蘇木素染細(xì)胞核：切片入Harris蘇木素染3-8min,，自來水洗,；

3）伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片入伊紅染液中染色1-3min，自來水洗,；

4）脫水封片：將切片依次放入95%酒精I(xiàn) 5min ,；95%酒精I(xiàn)I 5min；無水乙醇Ⅰ5min ,；無水乙醇Ⅱ5min ,；二甲苯Ⅰ5min ；二甲苯Ⅱ5min中脫水透明,，將切片從二甲苯拿出來稍晾干,，中性樹膠封片；

5）顯微鏡鏡檢,，圖像采集分析,。

6,、類器官鑒定-HE染色結(jié)果（以肺癌為例）

人肺癌類器官HE染色

二、免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

將HE染色步驟里脫蠟后的切片進(jìn)行如下處理：

1,、抗原修復(fù)：加入3%H₂O₂浸泡10min,，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，然后倒掉H₂O₂,，在清水中洗兩次,，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火）,，一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫,，然后再蒸煮一次,，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來,；

2,、血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉,，水洗2次,，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次,，擦干組織周圍的PBS液,，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來,，然后放入37°C溫箱中半小時(shí),。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）；
3,、加一抗：將溫箱中的載玻片取出,，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗,，如果做對照實(shí)驗(yàn),，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜,；
4,、加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次,，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37°C溫箱中半小時(shí),；
5,、加SABC：將片子從溫箱中取出,，放入PBS中洗3次，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時(shí),。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）；
6,、加顯色劑：將片子從溫箱中取出,，放入PBS中洗3次，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑,。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻,，然后加1滴顯色劑B,，搖勻， 再加1滴顯色劑C,，搖勻,，A：DAB， B：H₂O₂,，C：磷酸緩沖液）,；
7、復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后,，浸泡于蘇木精中染色半分鐘,；
8、脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯,。每個(gè)試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中,，搬到通風(fēng)柜中,；
9、封片：用中性樹膠滴在組織旁邊,，再用蓋玻片蓋上,，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。

三,、免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

將免疫組化步驟里一抗孵育后的切片進(jìn)行如下處理：

1,、加熒光二抗：PBS浸洗3次，每次3min,，吸干切片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,，濕盒中37℃孵育1h,，PBS浸洗3次；注意：從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟都盡量避光操作,。
2、復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min,，對標(biāo)本進(jìn)行染核,，用PBS清洗4次，洗去多余的DAPI,；
3,、封片：防熒光淬滅封片劑封片、熒光顯微鏡觀察,。

今天講解就到這了,，大家如有實(shí)驗(yàn)問題，歡迎公眾號后臺留言哦,！

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