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一,、肺癌類器官構(gòu)建——Organotial人肺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9443）

（1）取材后的組織須放在預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液的取樣瓶中,，快速轉(zhuǎn)運至潔凈實驗室進行組織處理和細胞分離，拍照并登記信息,。

（2）準備若干培養(yǎng)皿,，加入 4℃預(yù)冷的原代培養(yǎng)緩沖液備用。

（3）取樣瓶消毒,，將組織放入培養(yǎng)皿中,，利用原代培養(yǎng)緩沖液清洗三次后，去除雜質(zhì),，利用眼科剪或手術(shù)刀將組織剪切成體積約為1-3mm³的組織塊,。

（4）組織用人肺癌原代組織消化液消化，37℃震蕩消化10-20min（消化過程中隨時觀察消化情況）,。

（5）取少量液體在顯微鏡下觀察,，鏡下觀察到較多的單個細胞或70um以下的細胞簇后，加入三倍體積原代培養(yǎng)緩沖液終止消化,。

（6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)（abs7009）進行過濾,，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清,，添加原代培養(yǎng)緩沖液重新重懸離心,。

（7）基質(zhì)膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠（abs9495）重懸鋪板,。

（8）24孔細胞培養(yǎng)板為例,，每孔點膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。

（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠,，添加人肺癌類器官培養(yǎng)基（恢復(fù)室溫）進行培養(yǎng),。

二、多重熒光免疫組化鑒定——六色多重熒光免疫組化染色試劑盒（abs50014）

（1）樣本制備：類器官樣本制備,，參考類器官實操大本營之——固定包埋
（2）烤片：60℃烤片30min,。
（3）脫蠟、水化：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min),。
（4）抗原修復(fù)：取200ml抗原修復(fù)液,，加入染色盒中，將組織切片置于染色盒內(nèi)耐高溫塑料切片架上,，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓,，然后繼續(xù)加熱5min,，關(guān)閉電源，10min后取出染色盒,，室溫冷卻30min,，畫上阻水圈，置入PBST浸洗3次,，每次3min,。
（5）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：每切片加100μL3% H₂O₂，室溫下孵育10min,，PBST浸洗3min×3次,。
（6）封閉：除去PBST液，每張切片加100μL 5% 山羊血清封閉液,，室溫孵育30min,，除去封閉液。
（7）一抗孵育：每張切片加100μL一抗工作液,，室溫保濕孵育1h,，PBST浸洗3min×3次。
（8）二抗孵育：除去PBST,，每張切片加100μL二抗,，室溫保濕孵育15min，PBST浸洗3次,，每次3min,。
（9）染料孵育：除去PBST，每張切片加100μL現(xiàn)配的1*染料工作液（使用信號放大液按1:100稀釋）,，孵育10min后,，置入PBST內(nèi)洗滌，室溫浸片洗滌3次,，每次3min,。
（10）抗體洗脫：抗體洗脫液（abs994）37℃ 預(yù)熱，滴加少量抗體洗脫液覆蓋樣本,，室溫放置3~5min,；棄去洗脫液，再次滴加足量的洗脫液覆蓋樣本,，37°C 孵育20min,；PBST浸洗3次，每次3min,。
（11）重復(fù)步驟（6）-（10）,，直至所有目標抗體染色完成。
（12）核染：滴加1*DAPI工作液到樣品上,，浸沒樣本區(qū)域,，室溫孵育10min后,，用1*PBST浸洗玻片3次，每次2min,。
（13）封片：滴加抗熒光淬滅封片劑,，用蓋玻片封片，避免氣泡,。
（14）掃描成像,，數(shù)據(jù)分析。

Absin肺癌類器官多色風采展

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