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在進行細胞培養(yǎng)時,，首先要對新鮮取材的動物組織等進行處理,，或用機械的方法，或用胰蛋白酶,、膠原蛋白酶等處理一段時間,，將組織分散成單個細胞即原代培養(yǎng)。在進行傳代培養(yǎng)時,，貼壁細胞需要重新用胰蛋白酶等處理,，使之分散成單個的細胞。那么“胰蛋白酶"和“膠原蛋白酶"到底有什么區(qū)別呢,？我們在細胞培養(yǎng)時應該如何選擇,？

盡管胰蛋白酶和膠原蛋白酶都是細胞培養(yǎng)中常用于將體積較小的組織塊分散成細胞團或單細胞的消化液，但它們的作用機制及適用情況并不相同,。

一,、胰蛋白酶的作用特點

胰蛋白酶分離自牛、豬等動物的胰,，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鏈,，除去細胞間黏蛋白及糖蛋白，從而使細胞分離,，是應用廣泛的消化物,，適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織,，如胚胎組織,、羊膜、上皮組織,、肝,、腎等軟組織以及傳代細胞等。胰蛋白酶的消化作用與酶的濃度,、pH,、溫度、組織塊的大小以及組織的硬度都有關(guān)系,。胰蛋白酶濃度過大或消化時間太長,，會導致細胞被消化；但反之消化不充分也達不到分散細胞的目的,。此外,，血清明顯抑制胰蛋白酶的活性，Ca²⁺和Mg²⁺對胰蛋白酶的活性有一定抑制作用,。

根據(jù)細胞類型和實驗目的,，可選用含/不含EDTA或酚紅的胰蛋白酶，其作用如下：

EDTA（乙二胺四乙酸）：胰蛋白酶中的EDTA主要起到螯合金屬離子,，使細胞更容易分散的作用,。 EDTA可以螯合Ca²⁺ 或Mg²⁺,，而細胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結(jié)合的蛋白都是帶有Ca²⁺ 或Mg²⁺的，把這些離子螯合后,，可以加速細胞和培養(yǎng)皿的脫離,，促進消化。EDTA是2價陽離子螯合劑,，所以能螯合鈣,、鎂等離子。上皮類細胞的連接存在“橋粒"結(jié)構(gòu),，是細胞間最“牢固"的連接,，但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細胞時,，加入EDTA,，可以破壞細胞的橋粒結(jié)構(gòu)，使細胞能夠分散成單個細胞,。通俗地說,，就是破壞細胞間的粘連。

酚紅：胰蛋白酶中的酚紅主要是起到PH指示劑的作用,。胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范圍內(nèi)實現(xiàn),。在此范圍內(nèi)的酚紅呈粉紅色。由于環(huán)境條件,，胰蛋白酶的pH可能變?yōu)樗嵝?，呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4-7.6可以優(yōu)化胰蛋白酶活性,。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應,，培養(yǎng)細胞尤其是哺乳類細胞時,，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,，一些研究人員在做流式細胞檢測時,，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

濃度：一般常用胰酶的工作濃度為0.25%,，而半貼壁細胞或?qū)σ让该舾械募毎２捎玫蜐舛龋?.05%）的胰酶進行細胞消化,。

產(chǎn)品信息：

貼壁細胞消化實驗方案：

（1）吸去培養(yǎng)液，用無菌的PBS,、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細胞一次,，以去除殘余的血清。

（2）加入少量胰蛋白酶消化液,，蓋過細胞即可,，室溫放置1-2分鐘。不同的細胞消化時間有所不同,，對于貼壁牢固的細胞可適當延長消化時間,。

（3）顯微鏡下觀察，細胞明顯收縮,，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化,；或者用槍吹打細胞發(fā)現(xiàn)細胞剛好可以被吹打下來。此時吸除消化液,。加入含血清的細胞培養(yǎng)液,，吹打下細胞，即可直接用于后續(xù)實驗,。

（4）如果發(fā)現(xiàn)消化不足,，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

（5）如果發(fā)現(xiàn)細胞消化時間過長,，未及時吹打細胞,，細胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細胞培養(yǎng)液把細胞全部吹打下來,。1000-2000g離心1分鐘,，沉淀細胞，盡量去除胰酶細胞消化液后,，加入含血清的培養(yǎng)液重新懸浮細胞,，即可用于后續(xù)實驗,。

組織的消化：不同的組織需要消化的時間相差很大,，通常以消化后可以充分打散組織為宜。

二,、膠原蛋白酶的作用特點

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類,，主要用于水解結(jié)締組織中的膠原蛋白，適于消化纖維性組織,、上皮組織以及癌組織等,。當擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多的結(jié)締組織或膠原成分時,，用胰蛋白酶解離細胞效果較差,，可采用膠原酶解離細胞法。鈣、鎂離子以及血清不會影響膠原酶的消化作用,，其消化作用緩和,，且無需機械振蕩。

目前商業(yè)化的膠原酶因所含組分的差異分為五類,，其在應用上具有一定區(qū)分：

（1）膠原酶Ⅰ型：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶,、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶,、胰蛋白酶活性）,，通常用作上皮細胞、肝,、肺,、脂肪和腎上腺組織細胞的制備。

（2）膠原酶Ⅱ型：比I型膠原酶含更高的梭菌蛋白酶活性,，通常用作心臟,、骨、肝,、甲狀腺,、唾液腺和軟骨等組織的原代細胞制備。

（3）膠原酶Ⅲ型：含較低的次級蛋白酶污染物水解活性,，但具典型的膠原酶活性,。常用于乳腺組織的原代細胞制備。

（4）膠原酶Ⅳ型：含較低的胰酶活性以降低對膜蛋白和受體的損害,，通常用于胰島細胞制備,，和維持受體完整性比較重要的其他研究，也可用于髓系細胞制備,。

（5）膠原酶V型：含更高的膠原酶和酪蛋白活性,，更低胰酶水平以降低對膜蛋白和受體造成損傷。適用于胰島制備,。

產(chǎn)品信息：

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Absin特色產(chǎn)品線：

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