Q1：我該如何得到很好的多色結(jié)果呢,？
A1：首先，您需要有質(zhì)量不錯(cuò)的樣本和抗體,，這就已經(jīng)是成功的一半（樣本,、抗體選擇攻略），對(duì)于樣本來說,，脫片是我們需要預(yù)防的“頭號(hào)公敵",，多色實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)熱修復(fù)洗脫抗體多次，假如片子脫片,，輕則成像模糊,，重則組織脫落前功盡棄，可以在開始實(shí)驗(yàn)之前先模擬幾輪熱修復(fù),，不加抗體和其他試劑,，看看組織是否有脫落的跡象，如果脫落比較嚴(yán)重,，則需要重新制備切片,，如果有輕微脫片，則可以考慮購買抗體洗脫液（abs994）,，替代熱修復(fù)的過程,；然后，就可以開始做實(shí)驗(yàn)了,，我們建議您*行抗體和染料工作條件摸索,，再上多染（參考下圖流程），這樣多染的成功率可以達(dá)到90%以上哦?。ㄐ劢?jīng)驗(yàn)之談,，即便是染了千百遍的常見指標(biāo)，換個(gè)樣本,，染色效果就可能天差地別,，有條件還是建議要做預(yù)實(shí)驗(yàn),。）
最后的10%，就需要調(diào)整指標(biāo)與染料搭配以及染色的順序了,。
Q2：有沒有推薦的染料搭配和染色順序呢,？
A2：染料搭配一般遵循“寡靶配強(qiáng)光，眾靶配弱光"的原則,，意思是表達(dá)比較弱的指標(biāo)搭配熒光信號(hào)比較強(qiáng)的染料,，表達(dá)相對(duì)強(qiáng)的指標(biāo)搭配信號(hào)比較弱的染料，Absin的TSA染料波長越短熒光強(qiáng)度越強(qiáng),，比如說需要染PD-1,，CD8和CD3，我們手里有一個(gè)四色試劑盒（TSA520/TSA570/TSA650）,，通過IHC發(fā)現(xiàn)樣本中PD-1的信號(hào)很少,，CD3信號(hào)非常多，其次是CD8,，于是選擇TSA520搭配PD-1,，TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8,，比較合理,。
接下來就是怎么安排染色先后順序：
1）劃分細(xì)胞定位，先外后內(nèi)：確定每個(gè)指標(biāo)的細(xì)胞定位,，膜表達(dá)先染,，胞漿或者胞核的后染（如果是指標(biāo)比較多的情況下，胞內(nèi)指標(biāo)排在比較后面,，經(jīng)過前期多輪洗脫,，可以不做細(xì)胞通透；如果指標(biāo)很少,，染胞內(nèi)指標(biāo)之前還是需要打孔,，多個(gè)胞內(nèi)指標(biāo)也只需要打一次孔）；
2）確定抗原修復(fù)方式,，先酸后堿：堿修復(fù)比酸修復(fù)的力度會(huì)更強(qiáng),，個(gè)別抗體在用堿修復(fù)以后會(huì)染出來很多非特異性，所以如果是相同的細(xì)胞定位,，就先染酸修復(fù),，再染堿修復(fù)的抗體；
3）根據(jù)IHC結(jié)果判別,，先弱后強(qiáng)：組化結(jié)果顯示指標(biāo)比較少,，比較弱的，排在前面染，理論上來說越靠前染的指標(biāo)效果會(huì)越接近單標(biāo)染色,。
以上就是一些通用規(guī)則,，但不同的指標(biāo)還是可能出現(xiàn)變化，要想得到較好的結(jié)果,，就需要不同的排列組合一個(gè)一個(gè)嘗試（如下表,，“X"代表有信號(hào)），這樣會(huì)比較耗費(fèi)時(shí)間和試劑,，您可以根據(jù)通用規(guī)則先行一次多染,，然后各通道跟熒光單染做對(duì)比，如果效果差別很大,，那就再調(diào)整染色順序,，如果單染的結(jié)果跟組化差別比較大（出現(xiàn)高背景，非特異性明顯）,，就要考慮更換染料搭配,。
Target | Best Signal | Recommended | ||
1st AR | 3rd AR | 6th AR | ||
FOXP3 |
|
| x | 1:250 |
PD-1 | x |
|
| 1:250 |
LAG3 |
| x | x | 1:250 |
CD4 |
| x | x | 1:250 |
Q3：我成像完了以后想要做數(shù)據(jù)分析，你們有什么軟件推薦嗎,？
A3：目前市面上數(shù)據(jù)分析軟件還是比較多的,，像免費(fèi)的您可以下載imageJ、Qupath,，缺點(diǎn)就是用法都需要您自行摸索；我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件,，HALO是付費(fèi)的,，StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺(tái)自帶的，從功能,、分析的精準(zhǔn)度和可操作性來說,，肯定是大大優(yōu)于開源軟件的，且有軟件專業(yè)的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)能夠答疑解惑,。您可以根據(jù)您的實(shí)際情況選擇合適的分析軟件,，如果您實(shí)在無從下手，也可以找Absin,，我們可以提供數(shù)據(jù)分析的服務(wù)~
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Absin病理抗體指標(biāo)大全 | |
CD相關(guān)抗體 | CD3,、CD8a,、CD4、CD68,、CD206,、CD163、CD20,、CD19,、CD45、CD56,、CD10,、CD117、CD138,、CD14,、CD146、CD15,、CD1a,、CD2、CD21,、CD23,、CD25、CD30,、CD31,、CD34、CD35,、CD38,、CD3G、CD44,、CD5,、CD7、CD79a,、CD79B,、CD99 |
角蛋白（CK）相關(guān)抗體 | panCK、CK-4,、CK HMW,、CK-1、CK-10,、CK-14,、CK-17,、CK-18、CK-19,、CK-20,、CK-5、CK-5&6,、CK-6,、CK-7、CK-8,、CK-8&18 |
癌癥腫瘤相關(guān) | p120,、p16、p21,、p40,、p53、p63,、AFP,、ALK、AMACR,、ANXA1,、Aurora-B、Bcl-6,、CTNNB1,、CA125、CDK4,、CDX2,、CEA、CCND1,、c-MET,、c-Myc,、DOG1,、CDH1、EGFR,、EpCAM,、ERG、EZH2,、FABP3,、FGFR2、FOXP1,、GATA-3,、GCDFP-15、GPC3、GZMB,、HER-2,、IDH1 R132H、Ki-67,、LDLR,、MCM7、MCM3,、MGMT,、MSH2、MSH6,、MUC1,、MUC2、MUC4,、MUM1,、MyoD1、Myogenin,、Myosin (Smooth Muscle),、Napsin-A、N-Cadherin,、Olig2,、PAX-2、PAX-5,、PAX-8,、PCT、PD-1,、PHH3,、PLAP、PMEL-17,、PDPN,、PR、PSA,、PSAP,、S100A1、S100P,、SALL4,、SATB1、SF-1,、SOX10,、SOX11,、SOX2、STAT6,、Stathmin,、TCL1、TFE3,、TG,、TLE1、TOP2A,、TPO,、TRPS1、TTF-1,、Type I Cytokeratins,、Type II Cytokeratins、Uroplakin III,、Villin,、WT1、ZAP-70 |
神經(jīng)相關(guān) | ATRX,、p75 NGF Receptor,、CgA、DDX4,、GFAP,、λLight Chains、MBP,、NeuN,、Neurofilament、NSE,、Olig2,、p75 NGF Receptor、S100,、SYP |
血管 | ACE2,、VEGF、VWF |
鈣蛋白 | CALB1,、Caldesmon,、Calponin,、Calcitonin,、Calprotectin |
其他 | MPO、AR,、Arg-1,、AR-V7,、B2M、CLDN1,、Collagen Type Ⅳ,、COL4A5、ERα,、GH,、HBSAg、hCG,、hCG-beta,、hPL、IgD,、IgG,、IgM、IGFBP3,、Insulin,、Oct3/4、SCGN,、Somatostatin,、TDT、Actin,、Desmin |
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