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Q1：為什么每染一個(gè)抗體就要做抗原修復(fù)呢,，我可以只在第一個(gè)指標(biāo)做,，后面不做嗎,？

A1：不可以的，每染完一個(gè)抗體都是需要做抗原修復(fù)的,。染第一個(gè)抗體之前做抗原修復(fù),，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來(lái)，使得抗體能夠識(shí)別到抗原,；在染后面每一個(gè)抗體之前的抗原修復(fù),，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒(méi)有結(jié)合上的染料，其實(shí)更準(zhǔn)確的叫法是“抗體洗脫",，因?yàn)槲覀冏龆嗌珜?shí)驗(yàn),，沒(méi)有限制一抗的來(lái)源，您的一抗可能都是來(lái)源于兔子,，那我們對(duì)應(yīng)每一個(gè)一抗所使用的二抗都是抗兔,，如果不洗脫前一個(gè)一抗，染第二個(gè)抗體的時(shí)候,，二抗也會(huì)和上一輪的一抗結(jié)合,，產(chǎn)生大面積非特異性染色，所以抗體洗脫是整個(gè)多色實(shí)驗(yàn)不能缺少的核心步驟,。

Q2：抗原修復(fù)液（抗體洗脫液）每一輪修復(fù)都要更換嗎,？

A2：需要的，首先我們的抗原修復(fù)液需要根據(jù)下一輪要染的一抗來(lái)選擇,，有的一抗需要用檸檬酸修復(fù),，有的又需要EDTA修復(fù)，抗體廠家往往會(huì)注明他們的抗體需要用什么修復(fù)液,；其次,，就算我們所有的一抗都是推薦用檸檬酸修復(fù)，但每洗脫完一個(gè)指標(biāo),，修復(fù)液中都會(huì)殘留上一個(gè)指標(biāo)的抗體,，如果重復(fù)使用修復(fù)液，會(huì)對(duì)后面的指標(biāo)產(chǎn)生影響,，導(dǎo)致非特異性染色,。

Q3：我的組織有自發(fā)熒光，我還能做多色嗎,？

A3：一般情況下是可以的,。首先，您可以用熒光成像設(shè)備直接觀察您白片（不做任何處理的組織切片）的自發(fā)熒光情況,，可以每一個(gè)通道都成像試試,，看看自發(fā)熒光具體是在哪個(gè)或者哪些通道能夠觀察到；確定了自發(fā)熒光大概的波長(zhǎng)范圍以后，我們?cè)谶x擇多色染料的時(shí)候,，要避開(kāi)自發(fā)熒光所在的波長(zhǎng),，比如您的自發(fā)熒光在FITC通道能夠觀察到，在其他通道都沒(méi)有,，那對(duì)應(yīng)Absin多色染料有重合的就是TSA520,，在染多色的時(shí)候只要不選TSA520即可。當(dāng)然我們?yōu)榱吮荛_(kāi)自發(fā)熒光通道,，勢(shì)必要舍棄一些染料,，那最后能染的顏色數(shù)量也會(huì)相應(yīng)減少，并且假如您發(fā)現(xiàn)樣本在您儀器的所有熒光通道都能觀察到信號(hào),，那這個(gè)樣本就不適合用來(lái)做多色了,，需要重新制備樣本。

Q4：微波修復(fù),，高壓修復(fù),，抗體洗脫液洗脫，這幾種修復(fù)方式做出來(lái)的染色效果差別大嗎,？

A4：修復(fù)方式對(duì)染色效果的影響其實(shí)視一抗和樣本來(lái)定,。對(duì)于大部分的石蠟樣本，我們推薦用高壓熱修復(fù),，這種修復(fù)方式是大家一直認(rèn)為比較好的修復(fù)方式,，Absin實(shí)驗(yàn)室一直采用的也是高壓熱修復(fù)，當(dāng)然微波熱修復(fù)效果也不錯(cuò),，但不同微波爐的性能不同,，所以工作條件不能復(fù)刻,，需要做一些摸索,，并且微波熱修復(fù)可能會(huì)持續(xù)比較長(zhǎng)的時(shí)間，容易導(dǎo)致修復(fù)液蒸干影響效果,。而抗體洗脫液主要是針對(duì)一些無(wú)法采用熱修復(fù)或者熱修復(fù)容易脫片的樣本（如冰凍切片,、硬骨切片等），工作條件更溫和,，洗脫效果則取決于切片厚度,、洗脫溫度和時(shí)間、一抗種類（洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白 > 胞漿蛋白 > 胞核蛋白）,。對(duì)于能夠經(jīng)得起多輪熱修復(fù)的樣本,，我們更推薦采用熱修復(fù)。

Q5：做多色實(shí)驗(yàn),，除了多色試劑盒以外,，我還需要準(zhǔn)備什么材料呢？

A5：我們?cè)噭┖欣锩姘琓SA熒光染料,、染料稀釋液,、二抗,、DAPI、抗熒光淬滅封片劑,，除了這些以外的試劑都是需要您自己準(zhǔn)備的,，按照免疫組化的試劑準(zhǔn)備即可。最重要的是您需要配備熒光成像設(shè)備,。

Q6：我們實(shí)驗(yàn)室有熒光設(shè)備,，但我不知道能否用來(lái)觀察多色？

A6：您需要確認(rèn)您的熒光設(shè)備各個(gè)通道的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)（可以咨詢儀器廠家）,，跟我們熒光染料的波長(zhǎng)做匹配（見(jiàn)下表）,，我們提供的是最佳波長(zhǎng)，在該波長(zhǎng)下能夠得到很好的成像效果,，但假如參數(shù)相差30nm,，也是可以觀察到的；如果您確實(shí)無(wú)從得知具體的儀器參數(shù),，那也可以做一些近似波長(zhǎng)匹配,，比如您知道您的顯微鏡可以觀察FITC，那么對(duì)應(yīng)Absin多色染料近似是TSA520,；如果您發(fā)現(xiàn)您儀器的個(gè)別通道也不在我們近似波長(zhǎng)的清單中,，比如Texas Red，那您可以查一些資料確認(rèn)一下該染料的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)（Texas Red EX/EM：570/600nm）,，再去對(duì)應(yīng)Absin的染料參數(shù),，跟TSA620（EX/EM：590/620nm）比較近，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都在30nm范圍內(nèi),，那么判斷該通道是可以觀察TSA620這個(gè)染料的,。但染料近似匹配還是有可能存在觀察不了的情況，確認(rèn)儀器參數(shù)是很精準(zhǔn)的,，如果最后發(fā)現(xiàn)染完色確實(shí)成像不了,，也可以咨詢Absin掃片服務(wù)哦。

表1 Absin多色熒光染料波長(zhǎng)對(duì)照表

表3 Absin多重?zé)晒饷庖呓M化全套解決方案