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很多小伙伴都疑惑,，細(xì)胞被支原體污染后的特征是什么,？如何鑒別細(xì)胞被支原體污染了？今天,，我?guī)Т蠹曳窒韮蓚€支原體污染的案例,，共同探尋一下細(xì)胞被支原體污染后的特征。

圖1 感染支原體的EBTr（牛胚氣管細(xì)胞）

先來觀察一下被支原體污染的牛胚氣管細(xì)胞（圖1）,，由成纖維樣逐漸變得類上皮樣,；質(zhì)膜鋪展，潰爛,；輪廓不清,，邊界模糊。再看右圖,，細(xì)胞處于邊增殖邊凋亡的狀態(tài),，漂浮凋亡細(xì)胞過多。

圖2 感染支原體的HT1080（人纖維肉瘤細(xì)胞）

接下來再觀察一下被支原體污染的人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080（圖2）,，由上皮樣逐漸變得類成纖維樣,，胞體細(xì)長，和前面的牛胚氣管細(xì)胞形態(tài)變化剛好相反,；偽足伸長,，出現(xiàn)明顯的拉絲現(xiàn)象，表明細(xì)胞可能在“痛苦"地遷移,。使用了支原體殺除試劑（abs9375）,，清除了支原體以后，如右圖所示,，細(xì)胞逐漸恢復(fù)了上皮樣形態(tài),，拉絲減少,。

圖3 細(xì)胞膜上的支原體集落

接下來,，給大家展示貼附在細(xì)胞膜上的支原體集落（圖3），支原體是目前已知最小的原核生物,，直徑大小在0.1-0.3um,，比細(xì)菌還要小。支原體可在培養(yǎng)液,、細(xì)胞膜,、細(xì)胞內(nèi)增殖,。單個支原體需要借助于電鏡才可以觀察到具體形態(tài)，圖中膜上的黑點為支原體集落,。細(xì)胞背景干凈,，形態(tài)沒有大的變化，但質(zhì)膜粗糙,，布滿黑點,。

總結(jié)下來，細(xì)胞被支原體污染的主要特征如下：

? 增殖減慢,；

? 上清液澄澈,；

? 背景干凈；

? 細(xì)胞形態(tài)異常（拉絲,、鋪展）,；

? 更換新的培養(yǎng)液細(xì)胞狀態(tài)沒有恢復(fù)。

細(xì)胞被支原體污染后的共性表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減慢,、上清液澄澈,、背景干凈，這3點可以明確地排除真,、細(xì)菌污染,。值得一提的是，當(dāng)給細(xì)胞的營養(yǎng)體系不佳時,，細(xì)胞也會表現(xiàn)出形態(tài)異常,，所以，我們可以給細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液,，如果細(xì)胞也沒有恢復(fù)正常形態(tài),，此時判斷細(xì)胞極有可能被支原體“附身"了。

上述的判斷方法需要豐富的經(jīng)驗積累,，日常細(xì)胞培養(yǎng)中,，我們還可以用PCR擴增試劑盒檢測細(xì)胞是否有支原體污染。

圖4 支原體檢測試劑盒（PCR法）

產(chǎn)品優(yōu)勢： ? 本試劑盒檢測靈敏度高,，可檢測低至20個拷貝的支原體,； ? 實驗時間短，3小時即可完成,； ? 已在多個支原體品種上做過驗證,。

表1 產(chǎn)品組分表

該試劑盒檢測到的支原體類別主要有：

M.fermentans（發(fā)酵支原體）、M.hyorhinis（豬鼻支原體）,、M.arginini（精氨酸支原體）,、M. Orale（口腔支原體）、M.hominis（人型支原體）,、M.bovis（牛支原體）,、M.pneumoniae（肺炎支原體）,、M.pirum（梨支原體）、M.gallisepticum（雞毒支原體）,、Ureaplasma spp（解脲支原體）,、A.laidlawii（萊氏無膽甾原體） 等11種以上支原體。

作用原理：

試劑盒使用的混合引物是針對支原體16s rRNA序列的保守區(qū)域設(shè)計的特異性引物,，可直接使用細(xì)胞培養(yǎng)液作為PCR模板,，特異性擴增支原體DNA。

支原體檢測試劑盒（PCR法）使用方法

1,、樣品準(zhǔn)備

取適量待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清于潔凈的PCR管中（如果是血清樣本,，可用 Mycoplasma Free Water 稀釋），利用PCR儀95℃熱處理5min后作為模板,；

2,、PCR體系配制

每次實驗需設(shè)置陰性對照（將1μL待檢樣品換成等量的Mycoplasma Free Water）與陽性對照（在1μL待檢樣品中加入0.5μL Positive Control后一起作為Template），實驗時戴一次性口罩與手套,，謹(jǐn)慎操作,，防止操作不當(dāng)引入外源支原體污染；

3,、PCR程序設(shè)置

表2

4,、凝膠電泳

取10μL PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,；

5,、結(jié)果分析

每次實驗通過與陰性對照、陽性對照檢測結(jié)果比較確認(rèn)樣品支原體污染情況,，陽性條帶大小500bp左右,。如陰性對照檢測結(jié)果中有條帶很有可能是PCR體系中出現(xiàn)污染，建議重新實驗確認(rèn)結(jié)果,。如有必要,，也可對PCR產(chǎn)物進行常規(guī)測序，以確定具體的支原體種屬,。

如果您的細(xì)胞真的“中鏢"了,，也不要怕，我們的支原體殺除試劑為您的細(xì)胞披荊斬棘,，保駕護航,。

產(chǎn)品優(yōu)勢：
? 特異性清除培養(yǎng)基中的支原體；

? 只需要3-6天,，便可以有效清除支原體,；

? 活性成分為多肽類,，不會產(chǎn)生耐藥性,；

? 對細(xì)胞幾乎無毒性,，在100多種細(xì)胞上進行過驗證，包括但不限于 HEK293,、Hela,、MCF-7、MRC-5,、NIH-3T3,、CCC-ESF、CHO-S,、CHO-K1,、CHO-DG44、H295R,、HL-60,、K562、MDA-MB-231,、SP2/0,、T47D、BM和BV2等,；

? 廣譜性,，可替代雙抗，可以清除常見的革蘭氏陰性和陽性菌,；

? 可直接加入血清,、培養(yǎng)基中，用于清除支原體污染,；

使用方法：
1,、收到貨后，將試劑管瞬時離心（3000rpm,，3～5s）保存,。
2、推薦稀釋比例為1:1000,。例如10mL的培養(yǎng)基加入10μL的Treatment混勻,。
3、棄去舊的培養(yǎng)基,，用PBS將細(xì)胞清洗干凈,，再加入含有支原體清除劑的新鮮培養(yǎng)基，1天1次,， 連續(xù)處理3天,；或者2天1次，連續(xù)處理5～6天,。若細(xì)胞污染非常嚴(yán)重時,，需延長處理時間,。
4、若細(xì)胞對支原體清除劑敏感,，或生長明顯被抑制時,，請參考以下推薦參數(shù)。

表3

5,、處理完畢后,，加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中可添加支原體預(yù)防劑（abs9376）預(yù)防支原體再次污染,。

本期講解就到這里了,，如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎微信公眾號后臺留言,，或者掃描下方二維碼加入我們微信群交流~

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表4 細(xì)胞培養(yǎng)類產(chǎn)品推薦

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液,、預(yù)染marker、預(yù)制膠,；IHC相關(guān)：二抗試劑盒,、組化筆；IP/CoIP試劑盒,；激動劑/抑制劑,；血清、BSA,、蛋白酶K,、CTB、TTX,、CEE,；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒,；ELISA試劑盒,；重組蛋白；抗體: 二抗,、標(biāo)簽抗體,、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...