很多小伙伴都疑惑,，細胞被支原體污染后的特征是什么？如何鑒別細胞被支原體污染了,？今天,，我?guī)Т蠹曳窒韮蓚€支原體污染的案例，共同探尋一下細胞被支原體污染后的特征,。
圖1 感染支原體的EBTr（牛胚氣管細胞）
先來觀察一下被支原體污染的牛胚氣管細胞（圖1）,，由成纖維樣逐漸變得類上皮樣；質膜鋪展,，潰爛,；輪廓不清，邊界模糊。再看右圖,，細胞處于邊增殖邊凋亡的狀態(tài),，漂浮凋亡細胞過多。
圖2 感染支原體的HT1080（人纖維肉瘤細胞）
接下來再觀察一下被支原體污染的人纖維肉瘤細胞HT1080（圖2）,，由上皮樣逐漸變得類成纖維樣,，胞體細長，和前面的牛胚氣管細胞形態(tài)變化剛好相反,；偽足伸長,，出現(xiàn)明顯的拉絲現(xiàn)象，表明細胞可能在“痛苦"地遷移,。使用了支原體殺除試劑（abs9375）,，清除了支原體以后，如右圖所示,，細胞逐漸恢復了上皮樣形態(tài),，拉絲減少。
圖3 細胞膜上的支原體集落
接下來,，給大家展示貼附在細胞膜上的支原體集落（圖3）,，支原體是目前已知最小的原核生物，直徑大小在0.1-0.3um,，比細菌還要小。支原體可在培養(yǎng)液,、細胞膜,、細胞內增殖。單個支原體需要借助于電鏡才可以觀察到具體形態(tài),，圖中膜上的黑點為支原體集落,。細胞背景干凈，形態(tài)沒有大的變化,，但質膜粗糙,，布滿黑點。
總結下來,，細胞被支原體污染的主要特征如下：
? 增殖減慢,；
? 上清液澄澈；
? 背景干凈,；
? 細胞形態(tài)異常（拉絲,、鋪展）；
? 更換新的培養(yǎng)液細胞狀態(tài)沒有恢復,。
細胞被支原體污染后的共性表現(xiàn)為細胞增殖減慢,、上清液澄澈、背景干凈，這3點可以明確地排除真,、細菌污染,。值得一提的是，當給細胞的營養(yǎng)體系不佳時,，細胞也會表現(xiàn)出形態(tài)異常,，所以，我們可以給細胞更換新的培養(yǎng)液,，如果細胞也沒有恢復正常形態(tài),，此時判斷細胞極有可能被支原體“附身"了。
上述的判斷方法需要豐富的經驗積累,，日常細胞培養(yǎng)中,，我們還可以用PCR擴增試劑盒檢測細胞是否有支原體污染。
 圖4 支原體檢測試劑盒（PCR法） | 產品優(yōu)勢： ? 本試劑盒檢測靈敏度高,，可檢測低至20個拷貝的支原體,； ? 實驗時間短，3小時即可完成,； ? 已在多個支原體品種上做過驗證。 |
表1 產品組分表
| 組分 | 名稱 | 規(guī)格 |
| A | Mycoplasma PCR Mix（2x） | 1ml |
| B | Mycoplasma Primer Mix | 100ul |
| C | Positive Control | 50ul |
| D | Mycoplasma Free Water | 1ml |
該試劑盒檢測到的支原體類別主要有：
M.fermentans（發(fā)酵支原體）,、M.hyorhinis（豬鼻支原體）、M.arginini（精氨酸支原體）,、M. Orale（口腔支原體）,、M.hominis（人型支原體）、M.bovis（牛支原體）,、M.pneumoniae（肺炎支原體）、M.pirum（梨支原體）,、M.gallisepticum（雞毒支原體）、Ureaplasma spp（解脲支原體）,、A.laidlawii（萊氏無膽甾原體） 等11種以上支原體,。
作用原理：
試劑盒使用的混合引物是針對支原體16s rRNA序列的保守區(qū)域設計的特異性引物，可直接使用細胞培養(yǎng)液作為PCR模板,，特異性擴增支原體DNA,。
支原體檢測試劑盒（PCR法）使用方法
1、樣品準備
取適量待檢細胞培養(yǎng)上清于潔凈的PCR管中（如果是血清樣本，可用 Mycoplasma Free Water 稀釋）,，利用PCR儀95℃熱處理5min后作為模板,；
2,、PCR體系配制
每次實驗需設置陰性對照（將1μL待檢樣品換成等量的Mycoplasma Free Water）與陽性對照（在1μL待檢樣品中加入0.5μL Positive Control后一起作為Template），實驗時戴一次性口罩與手套,，謹慎操作,，防止操作不當引入外源支原體污染；
3、PCR程序設置
表2
| Step | Temperature | Time | Cycles |
| Initial Denaturation | 98℃ | 2 min | 1 |
| Denaturation | 98℃ | 20S | |
| Annealing | 56℃ | 25S | 30 |
| Extension | 72℃ | 10S | |
| Final extension | 72℃ | 5min | 1 |
| Hold | 4-16℃ | Forever |
4、凝膠電泳
取10μL PCR產物,，使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,；
5、結果分析
每次實驗通過與陰性對照,、陽性對照檢測結果比較確認樣品支原體污染情況,，陽性條帶大小500bp左右。如陰性對照檢測結果中有條帶很有可能是PCR體系中出現(xiàn)污染,，建議重新實驗確認結果,。如有必要，也可對PCR產物進行常規(guī)測序,，以確定具體的支原體種屬,。
如果您的細胞真的“中鏢"了,，也不要怕,，我們的支原體殺除試劑為您的細胞披荊斬棘,，保駕護航,。
產品優(yōu)勢：
? 特異性清除培養(yǎng)基中的支原體,；
? 只需要3-6天,，便可以有效清除支原體,；
? 活性成分為多肽類,，不會產生耐藥性,；
? 對細胞幾乎無毒性，在100多種細胞上進行過驗證，包括但不限于 HEK293、Hela、MCF-7,、MRC-5,、NIH-3T3、CCC-ESF,、CHO-S,、CHO-K1,、CHO-DG44,、H295R,、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D,、BM和BV2等,；
? 廣譜性,，可替代雙抗,，可以清除常見的革蘭氏陰性和陽性菌,；
? 可直接加入血清,、培養(yǎng)基中，用于清除支原體污染,；
使用方法：
1,、收到貨后，將試劑管瞬時離心（3000rpm,，3～5s）保存,。
2、推薦稀釋比例為1:1000,。例如10mL的培養(yǎng)基加入10μL的Treatment混勻,。
3、棄去舊的培養(yǎng)基,，用PBS將細胞清洗干凈,，再加入含有支原體清除劑的新鮮培養(yǎng)基，1天1次,， 連續(xù)處理3天,；或者2天1次，連續(xù)處理5～6天。若細胞污染非常嚴重時,，需延長處理時間,。
4、若細胞對支原體清除劑敏感,，或生長明顯被抑制時,，請參考以下推薦參數(shù)。
表3
| 大部分細胞 | 部分敏感細胞 | 少部分極敏感細胞 | |
| 稀釋比例 | 1：1000 | 1：2000 | 1：3000 |
| 處理時間 | 3天 | 6天 | 10天 |
5,、處理完畢后,，加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中可添加支原體預防劑（abs9376）預防支原體再次污染,。
本期講解就到這里了,，如有細胞培養(yǎng)問題，歡迎微信公眾號后臺留言,，或者掃描下方二維碼加入我們微信群交流~
注：圖源網絡和客戶,，僅供參考學習用
表4 細胞培養(yǎng)類產品推薦
貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
abs981 | 胎牛血清（特級） | 500ml |
abs972 | 胎牛血清（優(yōu)級） | 500ml |
abs974 | 胎牛血清（標準級） | 500ml |
abs9483 | 高糖DMEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9484 | RPMI-1640培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9505 | MEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9506 | α-MEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9554 | Ham's F-12培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9563 | Ham's F-12K培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9561 | DMEM/F-12培養(yǎng)基 | 500ml |
abs962 | PBS緩沖液 | 500ml |
abs970 | D-PBS緩沖液（不含 Ca2+ Mg2+） | 500ml |
abs971 | D-PBS緩沖液（含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs9257 | Hanks平衡鹽溶液（不含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs9258 | Hanks平衡鹽溶液（含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs47014938 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%） ，含酚紅 | 100ml |
abs47047375 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）,，不含酚紅 | 100mL |
abs9479 | 無DMSO無血清細胞凍存液 | 100mL |
abs9417 | 無血清細胞凍存液 | 100mL |
abs9473 | 細胞凍存液（含血清） | 100mL |
abs9474 | 組織保存液 | 100ml |
abs9480 | 組織凍存試劑盒 | 30ml |
abs9486 | 模具 | 1個/套 |
abs9487 | 小刀 | 5片/包 |
abs9481 | 組織復蘇試劑盒 | 50ml |
abs42020125 | 卡那霉素B硫酸鹽 | 250mg |
abs42018967 | 硫酸慶大霉素溶液 | 10ml |
abs9244 | 青鏈雙抗 | 100ml |
abs9245 | 青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液 | 100ml |
abs42013298 | 兩性霉素B | 1g |
abs44071148 | 制霉菌素 | 1g |
abs9246 | 青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液 | 100ml |
abs9252 | 支原體檢測試劑盒 | 100T |
abs9375 | 支原體清除試劑 | 200uL×5 |
abs9376 | 支原體預防 | 500uL×4 |
abs816578 | 環(huán)丙沙星鹽酸鹽 | 500mg |
abs9374 | 水盤抑菌劑 | 20ml |
abs9371 | 水浴鍋抑菌劑 | 100ml |
abs9372 | 培養(yǎng)箱除菌劑 | 480ml |
abs9373 | 細胞房除菌劑 | 480ml |
Absin特色產品線：
WB相關：ECL發(fā)光液,、預染marker、預制膠,；IHC相關：二抗試劑盒,、組化筆；IP/CoIP試劑盒,；激動劑/抑制劑,；血清、BSA,、蛋白酶K,、CTB、TTX,、CEE,；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒,；ELISA試劑盒,；重組蛋白；抗體: 二抗,、標簽抗體,、對照抗體；定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
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