細胞培養(yǎng)后，需要對其生長情況,、形態(tài)甚至生物學性狀進行觀察,。由于細胞小而復雜，若不借助適當?shù)氖侄?，難以觀察其形態(tài),、結構，更難發(fā)現(xiàn)細胞內各種組分的分子組成及功能,。目前,，已有多種研究細胞的技術，從光學顯微鏡到電子顯微鏡,，從一般細胞化學法到免疫化學法,。細胞染色是研究細胞生物學特征的一種常用手段，然而,，對于細胞實驗新手來說,，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻,、染色時切片脫落等都是很常見的問題,。今天小愛就為大家整理了幾種常用細胞染色方法及染色劑選擇指南，快來學習,！
表1 幾種常用細胞染色方法及特點
染色方法 | 染色特點及應用范圍 |
革蘭氏染色法 | 一種重要的細菌鑒別染色法,，經染色后，陽性菌呈紫色,，陰性菌呈紅色,，可以清楚地觀察到細菌的形態(tài)、排列及某些結構特征,，從而用以分類鑒定,。 |
瑞氏染色法 | 瑞氏試劑中酸性伊紅和堿性美藍混合經化學作用后，變成中性的伊紅化美藍,，久置后,，經氧化而含有天青。此三種染料分別和細胞中的NH3+和COO-等結合,，使細胞核及胞漿著色,。由于系中性染料，又有緩沖液調節(jié)酸堿度,，所以細胞受染后,，藍紅等顏色都較適中，核染質,、胞漿以及其中顆粒顯色較為清楚,。 |
姬姆薩染色法 | 病理學以及疾病研究中常用的染色劑。染色原理和結果與瑞氏染色法基本相同,。但該法對細胞核和寄生蟲著色較好,，結構顯示更清晰，而細胞質和中性顆粒則著色較差,。為兼顧二者之長，可用復合染色法,。 |
免疫組化染色法 | 利用抗原抗體之間的特異性結合,，用于研究細胞產物如分子、蛋白質或糖蛋白的表達,、定位,、分布和遷移等。 |
了解細胞染色方法后,，下面小愛向大家介紹研究不同細胞結構用到的熒光染料,。
一、細胞膜常用染料
DiD、DiR,、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2）,，它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態(tài)學和結構研究,。該系列染料進入細胞膜后,，會在整個細胞膜上側向擴散，在最佳濃度時可以使整個細胞膜染色,。其中DiD染料的染色效率高,，染色均一，熒光不易猝滅,，無明顯細胞毒性,，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應用于多種細胞的體內示蹤研究,，如Treg細胞,、間充質干細胞、腫瘤細胞,、造血干祖細胞等,。
表2 細胞膜常用染料及熒光顏色
貨號 | 產品名稱 | 熒光顏色 | λEx(nm)/ λEm (nm) |
abs47048165 | DiD 對氯苯磺酸鹽 | 紅色 | 644/663 |
abs45153692 | DiR 碘化物 | 深紅色 | 748/780 |
abs45153674 | DiO 高氯酸鹽 | 綠色 | 484/501 |
abs42002237 | DiI 高氯酸鹽 | 橙色 | 549/565 |
二、其他細胞結構常用染料
生物染料在細胞結構和組分鑒定中有著廣泛的應用,，除細胞膜研究外,，我們經常也會對一些其它細胞結構及成分進行探索，例如線粒體,、溶酶體,、蛋白質、細胞核等,，而對于不同的細胞結構有不同的染料進行染色,，小愛總結如下：
表3常用細胞染料及用途
貨號 | 產品名稱 | 產品用途 |
abs47047616 | DAPI染色液 | 細胞和組織細胞核染色。 |
abs47048270 | TRITC-Phalloidin | 選擇性結合絲狀肌動蛋白F-actin,，用于細胞骨架研究,。 |
abs47047622 | 臺盼藍染色液（0.4%） | 常用于檢測細胞膜完整性和細胞存活率。 |
abs47047618 | 姬姆薩染液 | 用于染色體,、血液,、組織切片、原生動物寄生蟲等,。 |
abs47047620 | Hoechst 33342 | 標記DNA,，也用于細胞核和線粒體的顯像觀察。 |
abs47047744 | JC-10 | 可以檢測細胞,、組織或純化的線粒體膜電位,。 |
abs47014951 | 吖啶橙鹽酸鹽 | 細胞周期研究,，細胞培養(yǎng)物和組織模型的凋亡研究。也能用作溶酶體染料,，但缺乏特異性,。 |
abs42023979 | (+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯 | 在溫和條件下標記蛋白質、肽,、細胞器,、抗體、寡核苷酸和微珠,。 |
三,、細胞染色神器DAPI + Phalloidin
DAPI染色液（DAPI Staining Solution）常用于細胞核染色，可將細胞核染成藍色,。鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是細胞骨架的染色神器,，羅丹明標記的Phalloidin（TRITC- Phalloidin）可將細胞染成橙紅色，DAPI與Phalloidin染色液是研究細胞形態(tài)變化時經常用到的兩種共染的試劑,，染色效果可見圖1[1]：A1-E1用TRITC-鬼筆環(huán)肽（橙紅）染色的細胞骨架免疫熒光圖,；A2-E2用DAPI（藍色）染色的細胞核免疫熒光圖；A3-E3合并的L929細胞免疫熒光染色圖,。圖2[2]是S100A16過表達或下調前后PDAC細胞形態(tài)的變化,。
注意事項：
※ 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測,；
※ 避免反復凍融,，否則容易失效；
※ DAPI對人體有刺激性,，注意適當防護,；
※ 鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量 LD50約 2mg/kg）,。
參考文獻
[1] Li J, Chen JN, Peng ZX, et al. Multifunctional Electrospinning Polyhydroxyalkanoate Fibrous Scaffolds with Antibacterial and Angiogenesis Effects for Accelerating Wound Healing[J]. Applied Materials & Interfaces. 2022.
[2] Li T, Ren TY, Huang CM, et al. YS100A16 induces epithelial-mesenchymal transition in human PDAC cells and is a new therapeutic target for pancreatic cancer treatment that synergizes with gemcitabine[J]. Biochemical Pharmacology 189 (2021) 114396.
Question | Answer |
Q1：用DAPI和鬼筆環(huán)肽染細胞的先后順序是什么,？ | 一般情況下先用鬼筆環(huán)肽對細胞骨架進行染色20~40分鐘，PBS清洗細胞2次,，再用DAPI復染10~20分鐘,。可根據實際染色情況縮短或延長時間,。 |
Q2：用DAPI染細胞核時,，整張圖片顯示藍色是什么原因？ | 染色時應注意滴加量不要太多,，否則會造成整張圖像呈現(xiàn)藍色背景，只需覆蓋上薄薄的一層即可,。此外,，熒光染料存在淬滅的問題,，建議染色后盡快檢測。 |
Q3：DAPI染色中避光的操作到底要多嚴格才不至于影響結果,？ | DAPI相對很容易染上色,，避光處理時加樣等操作短時見光沒有關系，但是不操作的時候需要暗盒或錫紙包裹,，染色后應盡快檢測,。 |
Q4：我的細胞樣品轉染了帶有GFP的質粒，應該選擇哪種鬼筆環(huán)肽,？ | 可以選擇TRITC（橙紅）或是Fluor 700（遠紅）標記的鬼筆環(huán)肽,。 |
Q5：鬼筆環(huán)肽有好多種，它們的區(qū)別是什么,？我應該如何選擇,？ | 主要是熒光基團的差異，激發(fā)不同的熒光顏色,，用來區(qū)分共染時其他熒光染料的顏色,，選擇時應滿足機器激發(fā)和發(fā)射波長。 |
Q6：鬼筆環(huán)肽可以染活細胞嗎,？什么染色劑可以染活細胞,？ | 鬼筆環(huán)肽不能直接應用于活細胞的染色，因為它無法穿越細胞膜,。DAPI可以透過完整的細胞膜,，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。 |
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