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70年代初期基因工程分子克隆技術的誕生將生命科學研究推入了一個快速發(fā)展的新時代,，以它作為研究的切入點許多的生物學難題取得了突破性解決,?；蚩梢栽谖锓N之間轉移表達，基因工程藥物得到開發(fā),，基因治療得以實現(xiàn),，轉基因植物、動物等農業(yè)新品種被培育出來,，生物進化從此進入了人類知識干預的歷史進程,。被評為世紀三大科學成就之一的“人類基因組測序"的實現(xiàn)，也是在分子克隆技術基礎上的人類一大杰作,。生命科學的內容不再是條塊分割的拼盤,，而是以分子生物學和細胞生物學的概念為一體的、統(tǒng)一的生物學,。

圖1 基因編輯（圖片來源于網絡）

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What,？分子克隆的概念

分子克隆（基因克隆/DNA重組/載體構建）技術在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法,。常含有目的基因,，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體,，通過轉化與轉導的方式,，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體,，可以得到插入DNA的許多拷貝,，從而獲得目的基因的擴增。其主要目的就是大量擴增目的基因,，為下一步的基因功能研究做準備,。可以應用于蛋白表達,、病毒包裝,、基因治療、細胞治療,、mRNA疫苗,、RNAi干擾、細胞功能等研究,。

圖2 分子克隆技術

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Why,？分子克隆原理

分子克隆技術簡單地可以理解為將DNA片段(或基因)與載體共價連接，然后引入寄主細胞,，再篩選獲得重組的克隆,。分子克隆方法的第一步是獲得所需的插入物（目的基因）,，目的基因可以是來自真核,、原核生物的任何細胞類型的DNA或mRNA,，也可以是實驗室直接合成的。通過PCR,、酶切等技術將基因組DNA或cDNA（通過mRNA體外逆轉錄合成cDNA）中分離得到一段含有目的基因的DNA序列,，通過產物純化后連接到線性化的載體上。關于載體一般常用到的是質粒載體,，它是一種小型環(huán)狀DNA分子—在基因工程中作為相對比較常用和簡單的載體,。與天然質粒相比，質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列,，并去掉了大部分非必需序列,，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作,。通過用相同的限制性內切酶(例如EcoRI等)切割載體DNA和外源DNA（目的基因）,，使切割后載體與外源DNA產生末端相容的構型。將載體和制備的目的DNA混合在DNA連接酶作用下進行連接反應,，從而完成了重組DNA的構建,。

完成目的基因與載體的重組后還不完事哦！要將重組DNA導入宿主生物體（一般選擇的是大腸桿菌）進行大量復制,。作為宿主的工程菌在某些化學條件或物理刺激下會改變其細胞膜的通透性,從而易于將細胞表面附著的外源基因吸收到胞內,這一過程即轉化,。利用選擇標記可以很容易鑒別成功導入目的基因的工程菌,比如抗生素抗性篩選——凡是成功導入重組載體的工程菌均獲得某種抗生素抗性,而未導入的工程菌則不能在含該抗生素的培養(yǎng)基中生長，這就是初步陽性菌株的篩選,。后續(xù)進行相應的陽性單克隆鑒定以及質粒測序即圓滿完成分子克隆實驗,。

圖3 質粒圖譜

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一般實驗流程

整個分子克隆從設計引物開始,根據(jù)需要拿到的目的蛋白相應地核酸序列,設計出含有酶切位點及所需Tag的特異性引物分子。剩下就是獲得目的基因,、酶切,、連接、轉化和篩選,、菌液PCR或酶切鑒定及測序比對,。主要的實驗流程如下圖所示，不同的克隆方法（我們下期繼續(xù)介紹）在酶切和連接的步驟會有所不同,，不同整體的流程基本一致,。

圖4 分子克隆技術一般流程圖

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