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隨著分子生物技術(shù)在生物學(xué),、醫(yī)學(xué)等方面的廣泛應(yīng)用，RNA提取已成為研究基因表達(dá),、克隆目的基因等的一項基本試驗技術(shù),。高質(zhì)量RNA的提取，是后續(xù)RT-PCR,、qPCR,、Northern blot、cDNA文庫構(gòu)建等正常進(jìn)行的必要前提,。Trizol法是一種常見的提取總RNA的方法,，在RNA得率及試劑成本方面具有一定的優(yōu)勢。

圖1 Trizol法提取RNA流程

Trizol是一種較為流行的總RNA抽提試劑,，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA,。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì),，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶,，因此對于純化RNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)來說使用價值相對比較高。

圖2

? Trizol是動植物細(xì)胞,、組織或者細(xì)菌的總RNA抽提試劑,；

? 主要含有苯酚,、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶,。苯酚主要用于裂解細(xì)胞,、變性蛋白，同時使部分RNase失活,，保護(hù)RNA,；異硫氰酸胍可降解細(xì)胞、溶解蛋白質(zhì),，使蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)消失,、使核蛋白與核酸分離，進(jìn)而使核內(nèi)的RNA被釋放出來,，并且抑制RNase活性,；

? 抽提所得RNA無DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值為8-2.0,；

? 裂解細(xì)胞或和組織共勻漿時,，Trizol可以保持樣品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解,；

? 每一百萬細(xì)胞用Trizol抽提可得5-15μg RNA,；每毫克組織用Trizol抽提可得1-10μg RNA，產(chǎn)量因細(xì)胞和組織不同而異,；

?Trizol抽提所得RNA可直接用于Northern,，點雜交，純化mRNA,，體外翻譯,，RNase protectionassay，cDNA克隆,，以及RT-PCR,；也可以用于基因表達(dá)芯片分析、高通量測序等對RNA質(zhì)量要求較高的情況,。

氯仿是分子量比較大的有機溶劑,，在提取RNA時，氯仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離,。加入氯仿,，離心后，樣品即分成水樣層（RNA存在于水樣層）,、中間層（DNA和蛋白質(zhì)存在于中間層）和有機層,。

細(xì)化它的主要作用點：

（1）作為有機溶劑變性蛋白，使其沉淀并通過離心除去,，同時也通過變性作用抑制RNase活性,；

（2）RNA提取試劑中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚）,，苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚,，如果不除去會損傷核酸,，需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；

（3）作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂,、脂溶性色素等）,，起到一定除雜作用。

異丙醇的作用主要是沉淀RNA,。RNA存在于水樣層中,，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA來還原。離心前沉淀不可見,，離心棄上清后，可見膠狀的RNA沉淀,。

75%乙醇主要由乙醇和DEPC水配置,，主要用來洗滌粘附在RNA沉淀上的氯仿跟異丙醇。

DEPC處理水是經(jīng)DEPC（即diethyl pyrocarbonate,，焦碳酸二乙）處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水（一級水）,，是一種無色液體。經(jīng)檢測不含雜質(zhì)RNA,、DNA,、核酸酶和蛋白質(zhì)。本產(chǎn)品可以用于RNA沉淀的溶解,，含有RNA的各種反應(yīng)體系,，以及其它要求無RNase、DNase和proteinase的反應(yīng)體系,。

一、細(xì)胞裂解

1,、組織樣本：

Trizol用量：每50-100mg 組織加1 ml Trizol,，樣品體積不應(yīng)超過Trizol體積的10％。

（1）將動物或植物組織切成小塊,，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理,；

（2）將研磨好的組織粉末快速轉(zhuǎn)入裝有1ml Trizol的2 ml離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻,，置于冰上,，待所有的樣品研磨完；

（3）裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體,。對于富含蛋白,、脂肪或多糖物質(zhì)的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結(jié)節(jié)部位等,，勻漿后仍會存留有不溶物質(zhì),，可于4℃ 12,000 x g 離心10min，然后吸取上清至一新的離心管中,。

2,、細(xì)胞樣本：

（1）貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，每10cm²培養(yǎng)面積（6孔板單孔或35 mm平皿）加入1ml Trizol,，用加樣器吹打數(shù)次,，以確保細(xì)胞裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中,。注：Trizol的使用量應(yīng)由培養(yǎng)皿表面積決定,，而非由細(xì)胞數(shù)目決定。Trizol量不足可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染,；

（2）懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞,，吸盡液體，每 5-10×10⁶動植物或酵母細(xì)胞,，或每 1×10⁷細(xì)菌細(xì)胞加入1ml Trizol,，用加樣器吹打，使其裂解,，然后轉(zhuǎn)移至離心管中,。

注：添加Trizol前切勿洗滌細(xì)胞 ，以免RNA降解,。必要時可以用勻漿器來裂解某些細(xì)菌或者酵母細(xì)胞,。

二、液相分離

（1）裂解產(chǎn)物于室溫放置5min,，使核酸-蛋白復(fù)合物分離,；（注：此時樣品可在-80℃長期保存,。）

（2）每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋,，劇烈振蕩15s,，室溫放置2-3min；

（3）4℃ 12,000 x g離心15min,，樣品會分成三層：桔黃色的下層有機相,，中間層和無色的上層水相；

（4）吸取含總RNA的上層水相至一新的離心管中,，吸取水相的體積為所用Trizol試劑的60％,。

三、RNA回收

（1）按照每1ml Trizol的最初使用量加入0.5ml異丙醇,，顛倒數(shù)次混勻,，室溫放置10min；

（2）4℃ 12,000 x g 離心10min,，棄除上清,，可見膠狀的RNA沉淀；

（3）按照每1ml Trizol的最初使用量加入1ml 75%乙醇,，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀,；

（4）4℃ 12,000 x g離心5min,，棄除上清；

（5）室溫倒置5-10min晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機,，以免RNA過干,，難以溶解）；

（6）加入適量（如25ul）DEPC-ddH₂O或TE緩沖液,，用加樣器吹打數(shù)次溶解RNA,；

（7）通過RNA電泳以及紫外分光光度計檢測，確定RNA的濃度,、純度和完整性,；

（8）所得的RNA應(yīng)立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融,。

除以上介紹的單品Trizol（abs60154）外,，還有Trizol(總RNA抽提試劑盒)（abs9331）包含有RNA提取全流程的試劑。

[1]袁琳, 代亞坤, 高炳淼. 改進(jìn) TRIzol 法提取不同發(fā)育時期?？目俁NA[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 48(4): 96.

[2]Eldh M, L?tvall J, Malmh?ll C, et al. Importance of RNA isolation methods for analysis of exosomal RNA: evaluation of different methods[J]. Molecular immunology, 2012, 50(4): 278-286.

[3]王華, 李華. 保存動物組織內(nèi) RNA 的方法改進(jìn)[J]. 生物技術(shù)通報, 2010 (6): 152-155.

Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液,、預(yù)染marker、預(yù)制膠,；IHC相關(guān)：二抗試劑盒,、組化筆,；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑,；血清,、BSA、蛋白酶K,、CTB,、TTX、CEE,；凋亡試劑盒,；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒,；重組蛋白,；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體,、對照抗體,；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...