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qPCR反應(yīng)之你問我答

閱讀：1218 發(fā)布時間：2023-1-11

實時定量PCR技術(shù)（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR）,，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進行定量分析的方法,。它是一項臨床上非常成熟的技術(shù),，目前在分子生物學(xué)領(lǐng)域，qPCR核酸定量好方法,。目前仍在全球肆虐的SARS-CoV-2鑒定的“金標準"——核酸檢測就是通過qPCR原理進行的,。

圖1 qPCR技術(shù)原理簡圖（圖片來自henrik's lab）

那么拿到一個樣本，需要經(jīng)過以下多項操作流程才能定量檢測到它的核酸含量,。其中任何一個步驟操作失誤都會導(dǎo)致它的檢測結(jié)果出現(xiàn)異常,，那讓小愛來帶您來看下出現(xiàn)常見問題的解答，為您解決qPCR實驗中的痛點,！

圖2 qPCR實驗操作流程圖

FAQ:

1,、無Ct值出現(xiàn)
a) 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號,。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性,。
c) 模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,。
e) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上,，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號,。

2,、Ct值出現(xiàn)過晚
a) 擴增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴增程序,，或者重新設(shè)計引物,。
b) 模板濃度太低：減少稀釋度,，重復(fù)實驗。
c) 模板降解：重新制備模板,，重復(fù)實驗,。
d) PCR產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設(shè)計為100 bp-200 bp之間。
e) 反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時帶入,，導(dǎo)致模板質(zhì)量不高,，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實驗。

3,、陰性對照出現(xiàn)明顯擴增
a) 反應(yīng)體系組分（如水）被污染：實驗過程中,，更換新的Mix或者水重復(fù)實驗。
b) 標本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制,，對實驗室進行嚴格的區(qū)分,，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭,。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),。
d) 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比,。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況,，可配合熔解曲線進行分析。

4,、熔解曲線出現(xiàn)多峰
a) 非特異性擴增,。
b) 引物設(shè)計不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
c) 引物濃度不佳：適當調(diào)整引物濃度,。
d) 退火溫度低：提高退火溫度,。
e) 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理），或通過設(shè)計引物避免非特異性擴增,。

5,、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴增條件，如提高退火溫度,，可利用梯度PCR,，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增,，因此引物設(shè)計時設(shè)定的成功退火溫度為60°C,。
b) 引物濃度太高，適當降低引物濃度,。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體,。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于100 bp以下,。

6,、擴增效率低
a) 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應(yīng)條件不佳：適當降低退火溫度或改為三步擴增法,。
c) 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入,，應(yīng)先把模板適當稀釋，再加入到體系中,，減少抑制物的影響,。

7、實驗重復(fù)性差
a) 加樣體積失準：使用性能較好的移液槍,，擴大反應(yīng)體積,，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中,。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準儀器,。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差,，減少模板稀釋度或提高加樣體積,。
d) qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻,。

除了實驗操作的解答外,，愛必信擁有全套qPCR解決方案來一站式幫您解決qPCR實驗難題。

愛必信qPCR全套解決方案推薦產(chǎn)品

類別	貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
樣本保存	abs9268	RNA樣品保存液	100mL
樣本保存	abs60330	RNA保護因子	50T
RNA提取純化	abs9331	Trizol(總RNA抽提試劑)	100mL
	abs60027	組織/細胞RNA快速提取試劑盒(Dnase I)	50T
	abs60030	病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒	50T
	abs60028	植物RNA快速提取試劑盒(DNase Ⅰ)	50T
	abs60029	全血RNA快速提取試劑盒(Dnase I)	50T
逆轉(zhuǎn)錄	abs60073	Reverse Transcriptase	10000U/10000U×5
	abs60076	Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)	50T/100T
	abs60246	逆轉(zhuǎn)錄一管化三代預(yù)混液	100T
qPCR	abs60309	一步法超級多重?zé)晒舛縋CR試劑盒(探針)	100T/250T
	abs60310	一步法超級熒光定量PCR試劑盒(探針)	100T/250T
	abs60093	Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit	100T/500T
	abs60086	SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix	1mL×5/1mL×25
	abs60087	SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX Premixed)	1 mL×5/1mL×25
	abs60088	SYBR qPCR SuperMix Plus(Low ROX Premixed)	1 mL×5/1mL×25
	abs60247	抗體染料法定量PCR預(yù)混液(通用ROX)	5×1mL
	abs60303	染料法熒光定量PCR試劑盒(化學(xué)修飾)	100T/200T/500T
	abs60304	染料法熒光定量PCR試劑盒(抗體修飾)	100T/200T/500T
	abs60305	探針法熒光定量PCR試劑盒	100T/200T/500T
	abs60306	UDG探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng))	100T/200T/500T
	abs60307	超級多重?zé)晒舛縋CR試劑盒(探針)	100T/200T/500T
	abs60308	UDG多重探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng))	100T/200T/500T

qPCR反應(yīng)之你問我答

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