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圖 1.人膽管類器官在 A 公司的基質(zhì)膠和 OrganoGel 基質(zhì)膠中的生長情況。人膽管類器官由細(xì)胞核染料 DAPI（藍(lán)色）,，緊密 連接蛋白抗體 anti-ZO1 和細(xì)胞骨架蛋白 F-actin 的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin 染色成像,。

圖2. 人原發(fā)腸癌類器官在A公司的基質(zhì)膠和OrganoGel基質(zhì)膠中的生長情況,。

圖3. 肝癌類器官在A公司的基質(zhì)膠和OrganoGel基質(zhì)膠中的生長情況。肝癌類器官由細(xì)胞核染料DAPI（藍(lán)色）,，肝臟細(xì)胞生物標(biāo)志物HNF4a和肝癌標(biāo)志物GPC3的抗體染色成像,。

圖4. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC 在 A 公司的基質(zhì)膠和 OrganoGel 基質(zhì)膠上均可形成血管網(wǎng)絡(luò)。HUVEC細(xì)胞由活細(xì)胞染料Calcein AM染色（綠色）成像,。

一,、 類器官培養(yǎng)（操作所需時間為 1 小時）

1. 將基質(zhì)膠于 4°C 冰箱里的冰上過夜解凍。

2. 將 24 孔板放置于培養(yǎng)箱預(yù)熱,。

3. 用預(yù)冷的槍頭將解凍的基質(zhì)膠進(jìn)行分裝,。

4. 準(zhǔn)備病人或者動物組織（或者類器官）來源的，細(xì)胞總數(shù)為 1X105的單細(xì)胞懸液,。300g 離心 5min,。

5. 取 50µL 的 OrganoGel 基質(zhì)膠與離心所得的細(xì)胞進(jìn)行混勻。

6. 取出預(yù)熱的 24 孔板,，立即將基質(zhì)膠與細(xì)胞的混合物滴加在孔板里,，立即將 24 孔板放入培養(yǎng)箱。

7. 約 10min 后,，基質(zhì)膠凝固后,，向孔板里加入 500µL 類器官培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),。

二,、腫瘤類器官藥敏實驗（操作所需時間為 2 小時）

1. 將擴(kuò)增好足夠量的腫瘤類器官（實驗組）以及正常類器官（對照組）用 4°C 預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，緩慢機(jī)械吹打,，促進(jìn)膠液化溶解,，并保持類器官結(jié)構(gòu)完整（可用于懸浮培養(yǎng)于有 5%基質(zhì)膠溶液的基質(zhì)膠表面）（Guillen et al. 2022）?；蛘咄ㄟ^ TryplE 酶消化獲得單細(xì)胞懸液,。

2. 離心收集類器官細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),。

3. 加入 OrganoGel 基質(zhì)膠原液,，與細(xì)胞進(jìn)行混勻。

4. 將細(xì)胞與膠的混合物,，通過排槍加入 37°C 預(yù)熱過的 96 孔板,，或者 384 孔板，立即將孔板放入培養(yǎng)箱,。

5. 大約 10min 后,，OrganoGel 基質(zhì)膠將凝固，加入相應(yīng)體積的類器官培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

6. 類器官形成后（如果是機(jī)械吹打,，類器官將在傳代 24h 后就會形成,；如果是酶消化，類器官會在 3-5 天 后形成）,，每個孔分別加入含有 PI 染料以及不同種類,、不同濃度的待篩選的抗腫瘤藥物。

7. 用高內(nèi)涵顯微鏡上進(jìn)行活細(xì)胞成像,，測定腫瘤類器官對各種藥物的敏感性,。

三、免疫缺陷小鼠成瘤實驗（操作所需時間為 1 小時）

1. 搜集用于注射小鼠的細(xì)胞 1X105個,，以 1:1 的體積與 OrganoGel 基質(zhì)膠混合,，為方便注射，建議每次注射總體積不低于 100µL,。

2. 用脫毛器對小鼠注射部位皮膚進(jìn)行脫毛,，然后用酒精棉球進(jìn)行消毒。

3. 用不帶針頭的 1mL 注射器將細(xì)胞和膠的混合物吸入針頭,，再裝上 16g 的針頭（針頭內(nèi)直徑為 1.194mm）,， 將混合物注射到皮下，或者大腿肌肉（針對代謝特別旺盛的腫瘤細(xì)胞）,。

四,、血管生成實驗（以永生化 HUVEC 細(xì)胞系為例，操作所需時間為 1 小時）

1. 將*培養(yǎng)基換成饑餓細(xì)胞用培養(yǎng)基：加入含 0.2% FBS,，2mM L-谷氨酰胺,，1mM 丙酮酸鈉，100U/ml 青 霉素和 100µg/ml 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 小時,。

2. 將 OrganoGel 基質(zhì)膠均勻鋪滿 96 孔板底,。注意：槍頭需提前預(yù)冷半小時。盡量在冰上操作,，避免基質(zhì)膠過早固化,，避免氣泡產(chǎn)生。

3. 將 96 孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 30min,，固化基質(zhì)膠,。

4. 消化 HUVEC 細(xì)胞，并計數(shù),。

5. 將 200µL 的 HUVEC 細(xì)胞懸液（含 5X104個細(xì)胞）加于含基質(zhì)膠的 96 孔板中,。將 96 孔板放于培養(yǎng)箱。

6. 血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將于 3 至 12 小時間形成,。

7. 在血管網(wǎng)絡(luò)形成最佳時間,，小心去除培養(yǎng)基，并用加入含活細(xì)胞染料 1/1000 Calcein AM（綠色）的培養(yǎng) 基進(jìn)行染色，并用顯微鏡進(jìn)行拍照記錄,。

五、神經(jīng)軸突 3D 生長實驗（以大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞為例,，操作所需時間為 2 小時）

1. 取孕期 12-15 天的大鼠胚胎,，用眼科剪和眼科鑷分離出大腦皮層于 4°C 預(yù)冷的 DMEM 培養(yǎng)基中。

2. 用吸管輕緩吹打,，然后用 70µm 濾網(wǎng)過來,，獲得單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),。

3. 離心（300g,，3min），棄上清,。將細(xì)胞與 OrganoGel 基質(zhì)膠進(jìn)行混合,，然后將基質(zhì)膠混合物滴加在 24 孔 板中，每孔 50µl,。

4. 將 24 孔板放于培養(yǎng)箱,，大約 10min 后，OrganoGel 基質(zhì)膠將凝固,。加入 1mL 神經(jīng)元分化培養(yǎng)基：Neurobasal medium,，2% B27, 2mM L-glutamine，5%FBS,，20ng/mL EGF 和 20ng/mLbFGF,，100U/mL penicillin 和 100 µg/mL streptomycin。第二天開始,，就能觀察到有明顯的神經(jīng)軸突生長,。

5. 在第 7 天可觀察到大量的神經(jīng)突（Neurite）長出。