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mRNA的5’端的帽子結(jié)構(gòu)可以提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、增強(qiáng)翻譯效率以及降低mRNA在細(xì)胞中的免疫原性【1】。作為mRNA的重要組成部分,，帽子結(jié)構(gòu)可以稱得上是mRNA結(jié)構(gòu)的保護(hù)傘,。那么，接下來我們就來學(xué)習(xí)一下帽子結(jié)構(gòu),。

• 帽子結(jié)構(gòu)簡介

帽子結(jié)構(gòu)的化學(xué)本質(zhì)是mRNA轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生修飾所形成的位于mRNA 5'端的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu),，即m7GPPPN結(jié)構(gòu)，又稱甲基鳥苷帽子,。它是在RNA三磷酸酶,，鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA（鳥嘌呤-N7）甲基轉(zhuǎn)移酶和mRNA（核苷-2’）甲基轉(zhuǎn)移酶共同催化作用下形成的,。甲基化程度的不同可形成3種帽子：CAP 0型,、CAP 1型和CAP 2型（如圖1）,。

 
圖1.不同位置甲基化形成的帽結(jié)構(gòu)【2】

帽子結(jié)構(gòu)是mRNA翻譯起始的必要結(jié)構(gòu),，為核糖體識別mRNA提供了信號，協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合,，使翻譯從AUG開始,。同時(shí)帽子結(jié)構(gòu)可增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻擊,。除去天然帽結(jié)構(gòu),，體外轉(zhuǎn)錄過程中也多用帽結(jié)構(gòu)類似物提高mRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，常見的有ARCA和Cap 1結(jié)構(gòu)類似物等,。

• 加帽方式及對比

酶法加帽：使用加帽酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加帽,，最常使用的是牛痘病毒加帽酶（VCE），該反應(yīng)過程中加帽酶的異源二聚體會導(dǎo)致產(chǎn)量較低,，短期內(nèi)難以放大,。特點(diǎn)：先轉(zhuǎn)錄后加帽，由于增加質(zhì)控項(xiàng)目工序繁雜（如圖2）,，加帽率*,，但各類酶成本較高。

共轉(zhuǎn)錄加帽：使用帽類似物進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄加帽,，目前常用的帽類似物有兩種ARCA（抗-反帽結(jié)構(gòu)類似物）和Cap1帽類似物,。有研究表明Cap 1結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)mRNA的翻譯效率，從而提高mRNA在轉(zhuǎn)染和顯微注射實(shí)驗(yàn)中的表達(dá),。且隨著帽子結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化,，加帽率大幅提升，成本逐漸降低,，共轉(zhuǎn)錄加帽法越來越受各類學(xué)者青睞,。特點(diǎn)：一步法加帽，操作簡單（如圖2），使用Cap 1結(jié)構(gòu)帽類似物,，加帽率可達(dá)95%,，隨著帽結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究的深入，成本逐漸降低【3】,。

 
圖2. 兩種加帽方式對比

• 三代帽子類似物及其對比

第二代帽結(jié)構(gòu)傳統(tǒng)帽類似物ARCA：Cap 0結(jié)構(gòu)非天然加帽,，存在較強(qiáng)免疫原性，加帽率80%左右,，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低約1.5mg/ml,，成本高。

第三代帽結(jié)構(gòu)Cap1帽類似物:  Cap 1結(jié)構(gòu)模仿天然加帽,，免疫原性降低,，加帽率95%左右，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低約4mg/ml,，成本約為ARCA帽類似物的三分之一,。

• 愛必信提供幾種類型CAP（AG/AU/GG）

• 帽結(jié)構(gòu)5月上新

除以上帽結(jié)構(gòu),，5月初我們即將重磅推出新修飾Cap 1帽結(jié)構(gòu)以及Cap 2帽結(jié)構(gòu)類似物的相關(guān)產(chǎn)品，敬請期待,。

【參考文獻(xiàn)】：

• Fabian M, Nils M, Andrea R. Synthetic mRNA capping[J]. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2017, 13:2819-2832.

• Chen, Yu & Guo, Deyin. (2016). Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virologica Sinica. 31. 10.1007/s12250-016-3726-4.

• Henderson JM, Ujita A, Hill E, Yousif-Rosales S, Smith C, Ko N, McReynolds T, Cabral CR, Escamilla-Powers JR, Houston ME. Cap 1 Messenger RNA Synthesis with Co-transcriptional Clean Cap® Analog by In Vitro Transcription. Curr Protoc. 2021 Feb;1(2):e39. doi: 10.1002/cpz1.39. Erratum in: Curr Protoc. 2021 Dec;1(12):e336. PMID: 33524237.