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一,、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP），是以（抗體和抗原）之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法,。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法,。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái),。區(qū)別于IP實(shí)驗(yàn),， CO-IP與IP只取決于檢測(cè)焦點(diǎn)是初級(jí)靶分子（抗原）還是次級(jí)靶分子（相互作用蛋白）

二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1,、提取蛋白,。

2、在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗體,。

3,、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質(zhì)上)。

若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白,，就可以形成復(fù)合物：“Y—X—抗X抗體—Protein A或G"

4,、經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳,，復(fù)合物又被分開(kāi),。（xy抗原、x抗體）,。

5,、western blot分析，質(zhì)譜分析,。

三,、CO-IP特征

優(yōu)點(diǎn)：

1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,，處于天然狀態(tài),。

2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,，可以避免人為的影響,。

3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物,。

局限性：

1,、可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用

2,、兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用,；

3,、必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇檢測(cè)的抗體,，若預(yù)測(cè)不正確,，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果

四、實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵

1,、實(shí)驗(yàn)需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題,。

2,、為防止蛋白的分解、修飾,，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑,，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3,、考慮抗體/緩沖液的比例,。抗體過(guò)少就不能檢出抗原,，過(guò)多則就不能沉降在beads上,，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原,，過(guò)多則抗原被稀釋,。

4、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中,，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的,，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。

五,、注意的問(wèn)題：

1,、裂解液

(1)、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件,，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用,，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的,，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定,。

(2)、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS),，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑,，

2、免疫沉淀中抗體的選擇

3、抗體

使用對(duì)照抗體：（陰性和陽(yáng)性）

陰性：?jiǎn)慰寺】贵w：同一種屬的IgG

兔多克隆抗體：正常兔IgG

陽(yáng)性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體（做膜蛋白A,，用膜蛋白B）

六,、未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白很少

可能原因

1、樣品被蛋白酶降解：

添加蛋白酶抑制劑,；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融

2,、抗體濃度太低：

調(diào)整抗體濃度，必要時(shí)設(shè)立濃度梯度,，摸索比較適合濃度

3,、抗抗體親合力太低：

選用適合于IP和/或IB的相應(yīng)抗體

4、IP抗體未與珠子結(jié)合：

選用適合于IP的相應(yīng)珠子,，正確保存防止變質(zhì)或干燥

5,、Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面：

改變tag融合表達(dá)部位

6、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高：

改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液

七,、目得蛋白高背景

可能原因

1,、非特異蛋白結(jié)合：

（1）在無(wú)血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞；

（2）在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預(yù)洗,，

（3）免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑）

2,、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低：

改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液。

3,、實(shí)驗(yàn)儀器或液體被污染：

使用潔凈的儀器或液體,。

4、轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附：

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