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做多了IHC實(shí)驗(yàn)的小伙伴,，相信對于抗原修復(fù)都不陌生，這看似簡單的一小步,，往往會對IHC實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生顯著影響,。愛必信作為您身邊的科研百寶箱，秉持著嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的態(tài)度,，為您總結(jié)了一系列從修復(fù)緩沖液,、煮沸裝置到修復(fù)方法，注意事項(xiàng)的小技巧,，希望這些小細(xì)節(jié)能完善您的實(shí)驗(yàn),，像愛必信一直堅(jiān)信的一樣，從小處入手,，時刻陪伴您的科研生活,，助力實(shí)驗(yàn)大成功。

抗原修復(fù)是針對石蠟包埋的切片的必要步驟,，大多數(shù)甲醛固定的組織在開始染色前都要先修復(fù)抗原,，這是由于在固定過程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點(diǎn),。常用的兩種方法為熱修復(fù)法（HIER）和酶解法。

一,、熱修復(fù)法

1. 熱修復(fù)緩沖液

適用于HIER的緩沖液有多種,，我們推薦兩種常用的緩沖液：pH 6.0，10mM檸檬酸鹽緩沖液和pH 8.0,，0.5mM EDTA緩沖液,。具體使用哪種緩沖液可以參考您的抗體說明書，通常來講,，EDTA緩沖液適合多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體,，而檸檬酸鹽緩沖液則適用于其他多數(shù)抗體。

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2. 熱修復(fù)方法

(1),、高壓蒸汽法

▲ 將合適的抗原修復(fù)緩沖液加入高壓鍋內(nèi),，然后將鍋置于加熱板并開至功率，此時不要把蓋子蓋緊,。在等待煮沸過程中,，進(jìn)行脫蠟復(fù)水。
▲ 煮沸后,，將玻片放入高壓鍋,，蓋緊蓋子，小心燙傷,。
▲ 高壓鍋達(dá)到壓力后,，維持3分鐘。
▲ 3分鐘后,，關(guān)掉加熱板,，將高壓鍋取下放置。
▲ 釋放蒸汽,，冷水冷卻鍋身,。壓力下降后打開鍋蓋，冷水冷卻10分鐘,。小心燙傷，修復(fù)完畢,。

注意事項(xiàng)：

● 3分鐘只是建議時間,，并不是所有抗原的修復(fù)時間，可以設(shè)置對照試驗(yàn),，分別設(shè)定1,、2、3,、4……分鐘進(jìn)行探索,，確定修復(fù)時間,。
● 確保玻片*冷卻再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

(2),、微波法

微波法不要使用家用微波爐,，沒有高壓環(huán)境，修復(fù)時間長,，會使切片解離,。請使用科研微波爐。

向微波爐容器中加入合適的修復(fù)緩沖液
▲ 將玻片放入容器,，置于微波爐內(nèi),。將溫度設(shè)置在98℃維持20分鐘以修復(fù)抗原
▲ 20分鐘后，取出容器放置于水中冷卻10分鐘,，小心燙傷,，修復(fù)完畢。

注意事項(xiàng)：

● 要確保修復(fù)緩沖液足以浸沒玻片幾厘米,，防止煮沸過程中變干,。
● 20分鐘同樣也是建議修復(fù)時間，可設(shè)置對照試驗(yàn),，自行探究修復(fù)時間,。
● 確保玻片*冷卻。

二,、酶解修復(fù)法

可依據(jù)抗體說明書選擇需要的酶,，如果沒有，胰蛋白酶適用于大多數(shù)福爾馬林/PFA固定后需要修復(fù)的抗原,。常使用的酶解修復(fù)方法有滴管法和浸泡法,。

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(1)、滴管法

▲ 將胰蛋白酶預(yù)熱至37℃,。小心的將組織切片周圍的水吸干,，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般50-100ul）。用吸管將酶溶液鋪蓋住整個切片,，注意不要弄壞組織

▲ 將玻片置于加濕器,，然后37℃孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上,，否則會因溫度不均影響染色質(zhì)量,。▲ 盛放玻片的容器先預(yù)熱再放入恒溫箱內(nèi),。

▲ 10-20分鐘后,，取出玻片，流水沖洗3分鐘。修復(fù)完畢,。

(2),、浸泡法

將水浴溫度設(shè)置為酶適宜溫度。向盛放玻片架的兩個容器中加入超純水,。容器放入水浴加熱,。
▲ 將玻片放入水浴箱其中一個容器加熱
▲ 用水浴箱中另一個容器中的熱水制備抗原修復(fù)緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱,。
▲ 將加熱過的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩,。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈,。

注意事項(xiàng)：

有些酶需要特殊緩沖溶液和活性輔助因子,。
● 水或緩沖液體積要足夠沒過玻片
● 若將冷玻片直接放入酶溶液中會使溶液溫度降低從而酶活性降低，導(dǎo)致抗原位點(diǎn)修復(fù)不*,。
● 盡可能快的準(zhǔn)備出抗原修復(fù)緩沖液以避免妨礙酶活性的發(fā)揮,。放入玻片之前使溶液達(dá)到需要的溫度。
● 10-20分鐘只是建議孵育實(shí)驗(yàn),?？勺孕性O(shè)置對照實(shí)驗(yàn)探究孵育時間。