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免疫組化的實驗步驟剖析(一)

閱讀:3655      發(fā)布時間:2017-12-22
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1、標(biāo)本固定:固定的目的是:  

        ①,,防止標(biāo)本從玻片上脫落,;

        ②,除去防礙抗原—抗體結(jié)合的類脂,,使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果,;

        ③,固定的標(biāo)本易于保存,。固定劑的選擇一般用 4%多聚甲醛,。

 

2、脫水,、石蠟包埋和制片:脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水,、對組織要*浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利,。否則容易裂片和脫片等,。

 

3、脫蠟和水化:這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng),。脫蠟可以先60度20min,,然后立即二甲苯1-3分別10min,但當(dāng)天制好的切片可以60度3-4h,。水化用梯度乙醇(由高到低),。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全,,而產(chǎn)生非特異性背景著色。

 

4,、抗原修復(fù):由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中,,發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用,從而失去抗原性,;因此要進行抗原修復(fù),。通過抗原修復(fù),使得細胞內(nèi)抗原決定族重新暴露,,提高抗原檢測率,。常用的修復(fù)方法從強到弱一般分為三種,高壓修復(fù),、微波修復(fù),、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種(具體的可以查閱相關(guān)資料),。

 

5,、細胞通透:目的是使抗體能夠充分地進入胞內(nèi)進行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100,、蛋白酶k等通透液,。如TritonX-100可以溶解細胞膜、細胞核膜,、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進入胞漿和胞核內(nèi),,這樣抗體就能順利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。

 

6,、滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素:在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中,,免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾,必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活,。滅活內(nèi)源性POD一般3%過氧化氫滅活時間短點,,而0.3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時間。

 

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