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2025/02/13
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細(xì)胞污染是生物實(shí)驗(yàn)室中常見的問題之一，輕則引起細(xì)胞狀態(tài)改變,，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性,，重則會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度,。因此,，預(yù)防細(xì)胞污染，是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵點(diǎn)之一
如何控制細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中的污染,？本期內(nèi)容，為大家提供一些關(guān)鍵的方法和策略,。
一,、生物污染
細(xì)胞的體外生存環(huán)境，可以說是「危機(jī)四伏」,?？諝庵衅≈鞣N肉眼難以捕捉的微生物，稍有不慎,，細(xì)胞就會(huì)被感染,。不僅如此，如果實(shí)驗(yàn)操作不夠規(guī)范,，還有可能出現(xiàn)細(xì)胞交叉污染的情況,。
1、細(xì)菌污染
細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物,，一般為微米級別,。細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的污染菌為大腸桿菌,、葡萄球菌、假單胞菌等,。
細(xì)胞發(fā)生細(xì)菌污染后,，有哪些癥狀？與其他污染相比,，細(xì)菌污染在細(xì)胞培養(yǎng)過程中「發(fā)病」更為迅速,，較容易被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)如下癥狀時(shí),，基本可以斷定,，細(xì)胞發(fā)生了細(xì)菌污染：
①細(xì)胞培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)迅速渾濁；
②靜置的培養(yǎng)液時(shí)不渾濁,，但稍加震蕩,，就有許多渾濁物漂起；
③顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂??；
④細(xì)胞停止生長、出現(xiàn)大量死亡,；
如果細(xì)胞不幸遭遇到了細(xì)菌污染的侵襲,，該如何應(yīng)對呢？我們建議直接將細(xì)胞丟棄,，并對培養(yǎng)環(huán)境消毒,。國際上大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用 Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾），對超凈臺(tái),、培養(yǎng)箱等環(huán)境進(jìn)行消殺,。
2、支原體污染
支原體（mycoplasma）是一類沒有細(xì)胞壁,、高度多形性,、部分可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的原核細(xì)胞型微生物，大小為 0.3 微米左右,。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細(xì)胞競爭營養(yǎng),，影響細(xì)胞生長,，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)偏差，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)如下癥狀時(shí),，基本可以斷定,，細(xì)胞發(fā)生了支原體污染：
①生長速率緩慢、活力下降,、易脫壁,；
②細(xì)胞形態(tài)改變,；
③細(xì)胞易聚團(tuán)；
④在顯微鏡下,，可見培養(yǎng)液中產(chǎn)生大量碎片（培養(yǎng)基不渾濁）,；
⑤在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液很快變黃（意味著培養(yǎng)液中有看不見的大量微生物繁殖,，營養(yǎng)被消耗）,；
由于支原體體型微小，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，普通光學(xué)顯微鏡很難觀察到,，只有在電鏡下才能拍到支原體的照片。細(xì)胞培養(yǎng)過程中的支原體污染,，會(huì)大量消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng),。98% 會(huì)附著在細(xì)胞表面，導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)發(fā)生異常,，甚至引起死亡,，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)生異常。
如果細(xì)胞被支原體污染,，該如何處理,？對與支原體污染的細(xì)胞，優(yōu)先考慮丟掉細(xì)胞,，重新培養(yǎng),。
①對于非常珍貴的細(xì)胞株（不可再得的）國際上使用 Mynox® Gold，做 4 周左右的支原體祛除持續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),。
②對于非常珍貴的細(xì)胞株或生物樣品（無法長期培養(yǎng)的）,，可使用 Mynox®，對細(xì)胞做 3 小時(shí)左右的祛除支原體處理,，處理完畢,，沖洗細(xì)胞，將樣品放入潔凈的培養(yǎng)液中,，重新培養(yǎng)或保存即可。
③對于已經(jīng)進(jìn)行到中途的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),，如果將培養(yǎng)的大量細(xì)胞丟棄,，會(huì)造成高昂的實(shí)驗(yàn)成本損失。對于這樣的情況,，補(bǔ)救辦法如下：在培養(yǎng)液中加入 10% 的 Zell Shield®（一種新型復(fù)合抗生素）,。按照廠家建議的方法，配合處理細(xì)胞,，培養(yǎng) 4 代以上,，基本可祛除支原體污染,。
④一些做原代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室，為了預(yù)防取原代細(xì)胞過程中可能會(huì)發(fā)生支原體污染,，實(shí)驗(yàn)人員也可以在培養(yǎng)液中加入 10% 的 Zell Shield®（一種新型復(fù)合抗生素）,，培養(yǎng) 4 代以上，即可撤掉 Zell Shield®,，此過程可有效預(yù)防支原體污染的發(fā)生,。
3、真菌污染
真菌是一類具真核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物,。真菌可以通過孢子延續(xù)種群,，典型的營養(yǎng)體為絲狀分支結(jié)構(gòu)?？晌廴炯?xì)胞培養(yǎng)基的真菌種類繁多,，最常見的有曲霉菌，白色念珠菌,，酵母菌,，黑霉菌，孢子菌等,。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)上述癥狀時(shí),，基本可以斷定，細(xì)胞發(fā)生了真菌污染：
①在細(xì)胞培養(yǎng)液中會(huì)形成淡黃色或白色的漂浮物,，肉眼可見,，但培養(yǎng)液在短期內(nèi)不變混濁；
②顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間或是培養(yǎng)液中,，有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀,，樹枝狀或管狀菌絲；
③多數(shù)菌絲在高倍鏡下可以觀察到鏈狀排列的菌株,，而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形,，散落在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長。
細(xì)胞發(fā)生真菌污染時(shí),，需要將細(xì)胞丟棄,，并對培養(yǎng)環(huán)境消毒，國際上大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用 Mycoplasma-off™噴霧劑,，對超凈臺(tái),、培養(yǎng)箱等環(huán)境進(jìn)行消殺。
二,、加強(qiáng)細(xì)胞間管理,，是解決細(xì)胞污染真正有效的方法
匯總了各大實(shí)驗(yàn)室的工作流程：
1、在正式進(jìn)入細(xì)胞間前，需要在緩沖隔離間佩戴好細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室專用的防護(hù)用具：口罩,、防護(hù)服,、鞋套等，開始實(shí)驗(yàn)前,，佩戴好手套,。
2、定期使用 Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾）,，對工作區(qū)域消殺（建議半個(gè)月一次,，但需根據(jù)細(xì)胞間實(shí)際使用頻率決定）。
3,、每次實(shí)驗(yàn)開始前,，和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用紫外線對細(xì)胞間進(jìn)行照射消毒,，實(shí)驗(yàn)操作前用酒精或 Mycoplasma-off™噴霧劑對操作人員的手套進(jìn)行噴涂消毒,。
4、在水浴鍋或培養(yǎng)箱水槽的水中,，加入 0.5% 的 Water Shield™,，可確保一個(gè)月內(nèi)水源不會(huì)變成支原體、真菌或細(xì)菌的污染源,。
5,、如果細(xì)胞間內(nèi)，發(fā)生多株細(xì)胞的聯(lián)合的支原體污染情況,，建議在做上述 1-4 的操作的同時(shí),，將液氮罐，也用 Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾）進(jìn)行消殺,，并更換潔凈的液氮,，（液氮罐中凍存的細(xì)胞發(fā)生支原體污染，也會(huì)在液氮中引起污染的的傳播）,。
上述內(nèi)容只分析了生物因素污染,，在實(shí)際培養(yǎng)過程中，可能還會(huì)發(fā)生物理或化學(xué)污染,，請自行排除,，本文不再贅述。
三,、使用高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)試劑,，降低細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)
胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基補(bǔ)充物，以維持細(xì)胞的生長和健康,。選擇高品質(zhì)的胎牛血清，可以盡可能降低細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)。
高品質(zhì)的胎牛血清,，血源清晰,、通過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，并在檢測報(bào)告上,，表明批次,、內(nèi)毒素含量、無菌檢測和病原檢測情況,、蛋白含量等指標(biāo),，清晰且明確。以科研人常用的 Ausbian 進(jìn)口特級胎牛血清為例,，澳洲血源,，內(nèi)毒素含量 ≤ 3EU/ml，無菌檢測和病原檢測結(jié)果均為「未檢出」病毒和細(xì)菌,，蛋白含量也有注明,，品質(zhì)如何，一目了然,！
