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離心機(jī)的使用方法及推薦
圖為杭州佑寧的MC-15K
離心機(jī)的原理是離心機(jī)在高速旋轉(zhuǎn)的過(guò)程中,，由離心力所導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)使懸浮于液體中的固體物質(zhì)形成沉淀,，也就是懸浮體液中質(zhì)量或體積較大的物體向轉(zhuǎn)頭半徑大的方向移動(dòng),，而質(zhì)量或體積較小的部分沉積在轉(zhuǎn)頭半徑較近的地方,。
上面我們提到了離心力這個(gè)概念,。離心機(jī)就是一個(gè)產(chǎn)生離心力的機(jī)器,，離心力與轉(zhuǎn)子半徑、轉(zhuǎn)速及樣品質(zhì)量有關(guān)：即F=Rmω2（F：離心力：R：半徑：m：樣品質(zhì)量：w：轉(zhuǎn)速）,，離心力是衡量離心機(jī)重要的參數(shù)之一,，也是離心機(jī)檔次的區(qū)別標(biāo)準(zhǔn)之一， 離心機(jī)在出廠的時(shí)候都會(huì)給出該離心機(jī)的大轉(zhuǎn)速與離心力,。
接下來(lái)我們就討論一下離心機(jī)的離心分離方法
高速離心機(jī)的幾種分離方法：
A.差速離心：逐次增加離心力,，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。
差速離心是一種常用的方法,。在這種方法中,，離心管在開(kāi)始時(shí)裝滿了均一的樣品溶液。通過(guò)在一定速度下一定時(shí)間的離心后,，就可得到兩個(gè)部份：沉淀和上清液,。
通常在次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中,。然后將收集到的上清液以更高速度離心,，把所需的粒子沉積下來(lái)。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng),，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中,。對(duì)于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心，直到達(dá)到所需要的分離純度為止,。
差速離心的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,，但分離純度不高。
B.密度梯度離心法：可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離,，具有很好的分辨率,。
（1）速率區(qū)帶法（ratezonal）：
根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度（S）。大致步驟如下：
在離心管中裝入密度梯度溶液,，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加（正梯度）,。
將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度,。
由于不同大小的粒子在離心力作用下,，在梯度中移動(dòng)的速度不一樣，所以經(jīng)過(guò)離心后會(huì)形成幾條分開(kāi)的樣品區(qū)帶,。
注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度,。離心過(guò)程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止,。
（2）等密度離心法（isopycnic）：
根據(jù)粒子的不同密度來(lái)分離,。離心過(guò)程中，粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶,。
密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度,。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中,。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn),。
注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定,，與時(shí)間無(wú)關(guān)，此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速,，只能改變區(qū)帶的相對(duì)位置,。
密度梯度分析法
（1）梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇：
A、應(yīng)具備的性質(zhì)：
梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求,，一個(gè)理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是：
所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍,。
具有某些性質(zhì)，如折射率,，據(jù)此可測(cè)定它的濃度,。
所形成的溶液粘度低。
不損傷所分離的樣品,。
離心分離后容易除去,。
不妨礙分離積分的分析。
B,、常用介質(zhì)種類：
表一,、常用梯度材料在20℃密度
B.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍：
表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用
表三,、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度
（2）,、梯度溶液的準(zhǔn)備：
計(jì)算,稀釋
（3）梯度形狀
梯度形狀分：線型、等速型,、階梯型,、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度,。
梯度形狀對(duì)于分離是否成功非常重要：
常用的是線型梯度,，適用于分離蛋白質(zhì)、酶,、激素,、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動(dòng)物病毒或昆蟲(chóng)病毒,。等速梯度以及長(zhǎng)液柱可增進(jìn)分離能力,，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒,。
B.梯度柱制備：
梯度液柱可以用手工或梯度儀制備
半注法：
為縮減離心時(shí)間,，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì)，中間加樣品,，上面鋪Buffer或液體石臘油,。
（4）加樣方法與加樣量：
將樣品加到梯度液柱上,，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去,，對(duì)于DNA一類易斷的脆弱樣品,，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對(duì)樣品的切割作用,。樣品濃度是梯度柱小密度的1/10（W/W）,。
（5）轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)：
（6）分離區(qū)帶的回收及檢測(cè)
離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：
a.穿刺法
穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出,，將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂,，可控制滴出速度。
b.虹吸法：
將一毛細(xì)管輕輕插入管底,，盡量防止梯度抖動(dòng),，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數(shù)或體積部分收取,。
c.加壓法：
通過(guò)一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部,，部分收集換出的溶液。
d.切割法：
采用的切割刀切割所需區(qū)帶,。
區(qū)帶檢測(cè)：
所謂區(qū)帶檢測(cè),，實(shí)際上是對(duì)水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測(cè)，通常只是測(cè)量在260或280mm時(shí)長(zhǎng)的吸收值,，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個(gè)分布,，這個(gè)操作通常稱之為在線（online）監(jiān)測(cè)。